世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定
Summary
カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート リーダーを使用したハイドロゲルの文化から直接測定されます。
Abstract
しばしば三次元 (3 D) 細胞培養システムが、生体内での細胞および機能をより密接に要約するので、二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも。しかし、三次元培養における細胞機能の測定より困難頻繁です。多くの生物学的アッセイは、3 D の文化で困難なことができる細胞材料の取得を要求します。この課題に対処する方法の 1 つは材料内の細胞機能の測定を有効にする新しい材料を開発します。ここでは、96 ウェル フォーマットで 3 D ゲルにおける細胞外マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性の測定の手法を提案します。このシステムで蛍光の MMP 分解センサー poly(ethylene glycol) (PEG) ハイドロゲルに修飾します。細胞遊走は蛍光強度に比例して、標準的なマイクロ プレート リーダーで測定することができます。96 ウェル フォーマットにこのアッセイの小型化アッセイの前 24 ウェルのバージョンと比較して条件ごとに 80% 50% と試薬の使用によって実験のセットアップに必要な時間の短縮。この試金はまた細胞機能の他の測定と互換性です。たとえば、代謝活性アッセイは、ここで示します同じハイドロゲル内の MMP 活性測定を同時に行なうことができます。ヒトメラノーマ細胞播種密度アッセイの作業範囲の適切なカプセル化の密度を決定するセルの範囲にわたってカプセル化でアッセイを発揮します。カプセル化細胞の 24 h 後 MMP と代謝活性の読み出し、細胞播種密度に比例します。1 つ出来る分解蛍光基質でアッセイをここで発揮、間分析と方法論はさまざまなハイドロゲル システムや他の蛍光センサーの適応かもしれません。このようなアッセイは、さまざまなアプリケーションのための実用的で効率的かつ簡単にアクセスできる 3 D 培養プラットフォームを提供します。
Introduction
三次元 (3 D) 培養システム多くの場合より密接に二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも生体内の細胞応答を要約、いくつか優れた出版物1,2,3を参照.しかし、細胞の機能を測定する三次元培養システムを利用して携帯電話の検索の難しさのために挑戦している、さらに処理のサンプルします。この難易度は、3次元培養システムで多くの細胞機能の測定を制限します。この困難を克服するために新しい技術が必要な 3 D 環境内で細胞機能の簡単な測定を可能にします。この必要性に対処する方法の 1 つは、3 D 細胞培養のサポートだけでなく、また、細胞の機能を測定するセンサーを組み込む材料の開発です。たとえば、いくつかのハイドロゲル システムは蛍光プロテアーゼ分解部分 3 D 環境4,5,6,7内プロテアーゼ活性の可視化を有効にするを組み込まれています。一方、これらのシステムは、もともと顕微鏡イメージングのために利用された、これらのシステムも 3 D で細胞機能の簡易測定を有効にする標準的なプレート リーダーを使用してグローバル ・ マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性用適応できます。環境8。
Mmp、亜鉛プロテアーゼのスーパーファミリーは、正常組織の恒常性と多くの疾患で重要な役割を果たします。Mmp が低下して細胞外マトリックス (ECM) を改造、サイトカインと細胞表面受容体を切断、他 Mmp の9,10をアクティブにします。Mmp は、関節炎、動脈硬化、アルツハイマー病、および癌 ( 9,10,11のレビューを参照してください) などの疾患、創傷治癒など生理学的なプロセスで重要な役割を果たします。癌で高い MMP の発現は癌の転移と予後不良12相関します。さらに、Mmp は、癌細胞の浸潤や移行、本質的に 3 D 現象13,14細胞プロセスを促進することによって腫瘍の進行に貢献します。したがって、基礎生物学的研究や薬剤のスクリーニングの試金など、多くの場面で 3 D 培養の MMP 活性を測定することに関心があります。
ペグ ゲルは、高含水率により 3 D 細胞培養、タンパク質吸着と可変自然への抵抗のため活躍しています。ペグ ヒドロゲルは、細胞接着を促進する増殖因子 β (TGF-β)の変換などの成長因子のテザリングを直接 RGD、RLD と IKVAV のような ECM 擬態ペプチドなど直接セルに関数、鎖の数と機能されて15,16。最近では、PEG ヒドロゲルよく5,8と細胞機能の測定を可能にするセンサー ペプチド修飾されてが。具体的には、ペグ ハイドロゲル システムの使用は修飾と蛍光標準プレート リーダー 3 D 培養細胞の MMP 活性の測定 MMP 分解ペプチドを有効に、それ以上の処理は必要ありません。これらのシステムは、細胞機能、代謝活性を含む他の測定。蛍光の MMP 分解ペプチド修飾 3 D ペグ ハイドロゲルとこれの使用のために必要な最初の最適化実験を示す示された結果で培養された細胞の MMP 活性の測定のためのプロトコルの説明ここでは、試金。ひと悪性黒色腫細胞 (A375) された播種アッセイの作業範囲内にある適切な播種密度を決定する量の範囲で蛍光ゲルでカプセル化されます。カプセル化の 24 h 後 MMP と代謝活性を標準的なマイクロ プレート リーダーを用いた測定しました。次に、MMP 活性アッセイの線形範囲内播種密度を決定するための代謝活性と正常化しました。最後に、得られた結果の再現性を反映するようにトリプリケート間変動パーセンテージ (%cv) のプレート内の係数を求めた。このメソッドには、シンプルで高速な 3 D 細胞培養、および最小限のサンプル処理とプロテアーゼ活性の簡易測定ができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
3 D の in vitro における細胞培養を繰り返す体内環境の多くの重要な側面です。3次元培養も評価する細胞機能になり、携帯電話の検索と多数のセルを必要と多くの生物学的アッセイ挑戦を伝達します。したがって、開発処理と 3次元培養システムの有用性を大きくさらにサンプルなし細胞機能の測定を可能にする単純な 3次元培養システム。ここで説明した 3 D システムは、様々 な異なるアプリ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、キング サウド大学 (KSU)、リヤド、サウジアラビア最初の著者のスポンサーと同様、オハイオ州がん研究 (OCR)、ああ、この仕事を資金調達のため米国を認めたいと思います。蛍光ペプチド センサーの分子量は、マトリックス、支援レーザー脱離イオン化法、キャンパス化学楽器センター質量分析及びプロテオミクスから支援を受けて飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法を用いて測定しました。オハイオ州立大学の施設。
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
Riferimenti
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