Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели
Summary
Здесь представлены протокол для инкапсуляции и культивирования клеток в poly(ethylene glycol) (PEG) гидрогели функционализированных с fluorogenic матрицы металлопротеиназы (СПП)-разложению пептида. Клеточных ММП и метаболической активности измеряются непосредственно из гидрогеля культур с использованием стандартного Гонав читателя.
Abstract
Часто трехмерные (3D) клетки культуры системы более тесно пилки в vivo клеточных реакций и функции чем систем традиционной культуры двухмерный (2D). Однако измерение функции клеток в 3D культуры зачастую является более сложным. Многие биологические анализы требуют поиска клеточного материала, который может быть затруднено в 3D культур. Одним из способов решения этой задачи является разработка новых материалов, позволяющих измерение функции клеток внутри материала. Здесь для измерения активности клеточных матрицы металлопротеиназы (СПП) в 3D гидрогели в формате 96-луночных представлен метод. В этой системе является функционализированных Гидрогель poly(ethylene glycol) (PEG) с датчиком fluorogenic горные ММП. ММП клеточную активность пропорциональна интенсивности флуоресценции и может быть измерена с читателем стандартного микроплиты. Миниатюризация этот assay в 96-луночных формат сократить время, необходимое для экспериментальной установки, использование 50% и реагента на 80% за состояние по сравнению с предыдущей версией 24-ну assay. Этот assay также совместим с другими измерениями клеточных функций. Например метаболической активности пробирного показано здесь, который может проводиться одновременно с измерений активности ММР в пределах же гидрогеля. Assay продемонстрировал с инкапсулирован в различных клеток, заполнение плотности для определения плотности соответствующие инкапсуляции для Рабочий диапазон assay клетки человека меланомы. После 24 ч клеток инкапсуляции ММП и метаболической активности показаний были пропорциональны посева плотность клеток. В то время как assay продемонстрировали здесь с одной fluorogenic разложению субстрата, пробирного и методологии могут быть адаптированы для широкого спектра других флуоресцентные датчиков и систем гидрогеля. Такие assay обеспечивает практических, эффективных и легко доступных 3D культивирования платформу для широкого спектра приложений.
Introduction
Трехмерная (3D) культуры системы часто более тесно пилки в vivo клеточных реакций чем систем традиционной культуры двухмерный (2D), увидеть несколько отличные публикаций1,2,3 . Однако используя 3D культуры систем для измерения функция ячейка была сложной из-за сложности поиска сотовой и далее пример обработки. Эта сложность ограничивает измерения многих клеточных функций в системах 3D культуры. Для преодоления этой трудности, новые методы необходимы позволяют легко измерения функции клеток в трехмерных средах. Один из способов решения этой задачи является разработка материалов, которые не только поддерживают 3D клеточной культуры, но также включать датчики для измерения функции клеток. Например несколько систем гидрогеля включили fluorogenic протеазы горные постановление возможность визуализации активности протеаз в трехмерных средах4,5,6,7. Хотя первоначально эти системы использовались для микроскопических изображений, эти системы также могут быть адаптированы для использования в глобальной матрицы металлопротеиназы (СПП) деятельности пробирного с помощью стандартной плиты читатель, позволяя снисходительный измерения функции клеток в 3D окружающей среды8.
Равенству, надсемейства цинка протеаз, играют важную роль в нормальной ткани гомеостаза и многих заболеваний. Равенству деградировать и переделывать внеклеточного матрикса (ECM), Клив поверхности рецепторы клеток и цитокинов и активировать другие равенству9,10. Равенству играют решающую роль в физиологических процессах, таких как заживление ран и болезней, как артрит, атеросклероз, болезнь Альцгеймера и рак (см. обзоры в 9,10,11). В рак высокие уровни выражения MMP сильно коррелируют с метастазами рака и плохой прогноз12. Кроме того равенству способствуют прогрессии опухоли путем поощрения вторжение раковых клеток и миграции, клеточных процессов, которые являются по своей сути 3D явлений13,14. Таким образом существует большой интерес в способность измерения активности ММР в 3D культуры во многих контекстах, включая основные биологические исследования и наркотиков скрининг анализов.
PEG гидрогели широко используются для 3D клеточной культуры благодаря их высоким содержанием воды, устойчивость к адсорбции белка и перестраиваемые характер. PEG гидрогели были функционализированных с числом постановление для прямого клеточной функции, такие как с ECM подражательный пептидов как РСЗ, RLD и IKVAV для облегчения клеточной адгезии, или прямой, привязывая факторов роста, такие как преобразование фактор роста β (TGF-β) 15,16. Совсем недавно гидрогели PEG были функционализированных с пептидами датчиков, позволяющих измерение клеточной функции как хорошо5,8. В частности использование системы гидрогеля PEG функционализированных с fluorogenic MMP-разложению пептид включено измерение клеточной активности ММР в 3D культур с читателем стандартной плиты и требуется дальнейшая обработка не. Эти системы также совместимы с другими измерениями клеточной функции, в том числе метаболической активности. Здесь описывается протокол для измерения активности ММР клетки культивировали в 3D PEG гидрогеля функционализированных с fluorogenic пептид MMP-разложению и представлены результаты демонстрируют первоначальной оптимизации эксперименты, необходимые для использования этого анализа. Клетки человека меланомы (A375) были инкапсулированы в fluorogenic гидрогелей в диапазоне посева плотности, чтобы определить соответствующие плотности посева, которые находятся в пределах Рабочий диапазон assay. После 24 ч инкапсуляции ММП и метаболической активности были измерены используя стандартный Гонав читателя. Далее деятельности МЦП нормализована метаболической активности для определения плотности посева в пределах диапазона линейной assay. Наконец между triplicates отразить воспроизводимость полученных результатов были рассчитаны интра плита коэффициент вариации в процентах (% CV). Этот метод позволяет просто и быстро 3D клеточной культуры и легко измерения активности протеаз с минимальным образец обработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D в пробирке клеточной культуры резюмирует многие важные аспекты в естественных условиях окружающей среды. Однако 3D культуры также делает оценки функции клеток и сигнализации сложной, как многие биологические анализы требуют поиска сотовой и большое количество клеток. Таким образом, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Огайо исследования рака (OCR), Огайо, США для финансирования этой работы, а также король университет Сауд (КГУ), Эр-Рияд, Саудовская Аравия для авторов первого автора. Молекулярная масса датчика флуоресцентные пептид была измерена с помощью матрицы помощь, лазерной десорбции ионизации, время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии с помощью кампуса химических инструмент центр масс спектрометрии и протеомики Фонд в университете штата Огайо.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
Riferimenti
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -. M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening – from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
