Isolation og adoptiv overførsel af højt saltindhold behandlet Antigen-præsenterer dendritiske celler

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere dendritiske celler fra murine milt af magnetiske celle sortering og efterfølgende adoptiv overførsel til naive mus. Model af høj-salt aktiveret dendritiske celler blev valgt til at forklare de trinvise procedurer adoptiv overførsel og flowcytometri.

Abstract

Overskydende salt indtagelse bidrager til inflammation og spiller en afgørende rolle i udviklingen af hypertension. Vi har tidligere fundet at antigen-præsenterer dendritiske celler (DCs) kan fornemme forhøjede ekstracellulært natrium fører til aktivering af NADPH oxidase og dannelsen af isolevuglandin (IsoLG)-protein adukter. Disse IsoLG-protein adukter reagerer med self-proteiner og fremme en autoimmun-lignende tilstand og hypertension. Vi har udviklet og optimeret state-of-the-art metoder til at studere DC funktion i hypertension. Her, vi leverer en detaljeret protokol for isolation, i in vitro behandling med forhøjet natrium og adoptiv overførsel af murine milt CD11c⁺ celler til recipient mus til at undersøge deres rolle i hypertension.

Introduction

Overskydende kosten salt er en stor risikofaktor for hypertension. ^{1 , 2} the American Heart Association anbefaler op til 2.300 milligram (mg) natrium (Na⁺) indtag pr. dag, dog; mindre end 10% af den amerikanske befolkning bemærker denne henstilling. ^{3 , 4} beskedne reduktioner i Na⁺ indtag sænke blodtrykket og mindske de årlige nye tilfælde af koronar hjertesygdomme og slagtilfælde i USA med 20%. ⁵ et stort problem med overskydende salt forbrug er, at 50% af befolkningens hypertensive udstiller salt-følsomhed, defineret som en 10 mmHg stigning i blodtrykket efter Na^{Na+ lastning eller et lignende fald i blodtrykket +} begrænsning og diurese. ⁶ salt-følsomhed også forekommer hos 25% af normotensive personer, og er en uafhængig prædiktor for død og kardiovaskulære hændelser. ^{7 , 8} salt-sensing mekanismer i forhøjet blodtryk med nyre er blevet godt undersøgt; Nylige undersøgelser tyder dog på at immunceller kan fornemme Na⁺. ^{9 , 10}

Seneste beviser tyder på, at ændringer i ekstra renal Na⁺ håndtering kan forårsage ophobning af Na⁺ i interstitium og fremme inflammation. ^{11 , 12} vores laboratorium og andre har vist, at celler af både medfødte og adaptive immunsystem bidrager til forværring af hypertension. ^{9 , 13 , 14 , 15} forskellige hypertensive stimuli, herunder angiotensin II, noradrenalin og salt årsag makrofager, monocytter og T lymfocytter til at infiltrere den nyre og vaskulatur og fremme Na⁺ fastholdelse, vasokonstriktion, blodtryk elevation og ende-orgel skade. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} i forudgående undersøgelser, vi fandt, at DCs akkumulerer isolevuglandin (IsoLG)-protein adukter svar på forskellige hypertensive stimuli herunder angiotensin II og DOCA-salt hypertension. ¹⁴ IsoLGs er meget reaktive produkter af lipid fedtstoffer, der hurtigt og kovalent addukt til lysines på proteiner og deres ophobning er forbundet med DC aktivering. ¹⁴ vi har for nylig etableret, forhøjet Na⁺ er en potent stimulus for IsoLG-protein addukt dannelse i murine DCs.⁹ Na⁺ indrejse i DCs er medieret gennem amilorid følsomme transportvirksomheder. Na⁺ er derefter veksles til calcium (Ca^{2 +}) via Na⁺/Ca^{2 +} veksleren. Ca^{2 +} aktiverer protein kinase C (PKC) som aktiverer NADPH oxidase fører til øget superoxid (O₂^{· –}) og IsoLG-protein addukt dannelse. ⁹ adoptiv overførsel af salt-eksponerede DCs primtal hypertension som svar på en sub pressorstoffer dosis af angiotensin II. ⁹

Identifikation af CD11c⁺ DCs fra væv har været tidligere begrænset til Immunhistokemi og RT-PCR, og isolering af DCs har været begrænset til celle sortering ved flowcytometri. Selv om strømmen flowcytometri celle sortering er en kraftfuld metode til isolering af immunceller, det er dyrt og tidskrævende, og fører til et lavt udbytte af levedygtige celler. Derfor, vi har optimeret en trin for trin protokol for væv fordøjelse, in vitro stimulation og adoptiv overførsel af CD11c⁺ DCs at studere hypertension.

Protocol

Vanderbilt Universitys institutionelle Animal Care og brug Udvalget har godkendt de procedurer, der er beskrevet heri. Mus er opstaldet og plejes i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (nationale akademier presse. Revideret 2010). 1. isolering af milt fra mus Forberede 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin. Aflive 10 – 12 ugers-gamle C57bl/6 mandlige mus af CO<…

Representative Results

Figur 1 repræsenterer en skematisk af trinene beskrevet ovenfor. Isolerede murine milt er sorteret for CD11c+ DCs af magnetiske celle sortering og forgyldt i enten normale salt medier (NS; 150 mmol NaCl) eller høje salt medier (HS; 190 mmol NaCl) for 48 h. CD11c+ DCs overføres derefter adoptively af retro-orbital injektion til naive recipient mus. Ti dage senere, er mus implanteret med osmotisk minipumps for lav-dosis angiotensin II (…

Discussion

I den nuværende protokol, vi har optimeret procedurer for at isolere CD11c⁺ DCs fra milt af mus og adoptively overføre dem til naive dyr at studere DCs rolle i salt-induceret hypertension. Denne protokol kan tilpasses til at isolere og adoptively overføre andre immun celle subsets herunder makrofager, monocytter og adaptive immunceller, herunder T- og B-lymfocytter. Vi har optimeret milt fordøjelsen proces for at opnå tilstrækkelig celle overlevelse og stabilitet af DC overflade udtryk markører. Derudov…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030