Мы представляем протокол простого супрессор экрана в деления дрожжей. Этот метод является эффективным, мутагены бесплатно и селективного мутаций, которые часто происходят в одном локусе геномной. Протокол подходит для изоляции перенапряжения, которые облегчить роста дефектов в жидких культуры, которые вызваны мутации или наркотиков.
Генетических экран для мутантных аллелей, которые подавляют фенотипические дефекты, вызванные мутация представляет собой мощный подход к идентификации генов, которые принадлежат к тесно связанных биохимические пути. Предыдущие методы, такие как синтетические генетических массив (SGA), методам анализа и случайных мутагенеза с помощью ультрафиолетового (УФ) или химических веществ, как этиловый метансульфонат (EMS) или N-этил N-Нитрозомочевина (ENU), широко используется, но часто являются дорогостоящими и кропотливая. Кроме того эти методы на основе мутаген скрининга, часто связаны с серьезных побочных эффектов на организм, вызывая несколько мутаций, которые добавить сложности изоляции супрессоров. Здесь мы представляем простой и эффективный протокол для выявления подавитель мутации в мутантов, которые наделяют рост дефекта в Делящиеся дрожжи. Для восстановления с использованием автоматизированных 96-луночных пластины читателя в течение продолжительного периода может контролироваться фитнес клеток с роста дефицита в стандартной жидкости мультимедиа или синтетических жидких сред. Когда ячейка приобретает подавитель мутации в культуре, его потомки переиграть родительских клеток. Восстановленные клетки, которые имеют преимущество конкурентной роста над родительской клетки можно затем изолированные и backcrossed с родительской ячейки. Подавитель мутации затем идентифицируются с помощью всего генома. Используя этот подход, мы успешно изолированы несколько перенапряжения, которые смягчить серьезный рост дефекты, вызванные потерей Elf1, семейству AAA + АТФазы, что важно в ядерный транспорт мРНК и поддержание геномной стабильности. Есть в настоящее время над 400 генами в S. pombe с мутантами, присвоении рост дефекта. Как многие из этих генов uncharacterized, мы предлагаем, что наш метод будет ускорить выявление Роман функционального взаимодействия с этой удобной, высок объём подходом.
Основы понимания функциональных связей между генов опирается на способность определить молекулярных механизма(ов), в которой сложных генетических признаков расходятся производить разнообразные фенотипов1. В деления дрожжи, Делящиеся дрожжи (S. pombe), большинство белков кодирование генов являются необязательным для жизнеспособности2. Этот результат не говорю незначительность этих генов, а скорее замысловатые компенсаторные механизмы, лежащие в основе биохимические пути, к которым принадлежат такие гены. Пройдя эти компенсаторные механизмы вызвала Эпистаз карты, которые обнаружили всеобъемлющей генетических взаимодействий и расширить наше понимание функциональных биохимические пути3,4.
Разработаны методы высокой пропускной способностью (например, синтетические генетических массив анализа или SGA) для выявления генетических взаимодействий генома общесистемной в многообещающий дрожжей и были расширены для использования в деления дрожжевой5,6. Такие подходы часто полагаются на Библиотека штаммов, содержащий все жизнеспособные одного белка кодирование гена удаления (около 3300 гаплоидным удаления мутантов охватывающих свыше 92% генома деления дрожжей) и требуют робот-манипулятор для выполнения генетических кресты между штамм интерес и все возможные штаммов в library6. Кроме того SGA методов зависит от способности библиотека штаммов для надлежащего и эффективного спаривания, фенотип, что является ненормальным на 444 в настоящее время характеризуется генов в S. pombe2.
Несмотря на сложности генетических взаимодействий, сравнивая фенотип штамм, перевозящих мутации в двух генов к фенотипу двух штаммов, перевозящих отдельные мутации каждого гена может иметь один из двух заметных результатов: 1) является двойной фенотипом мутанта хуже, чем ожидаемый мультипликативной родителей фенотипы в форме болезни или, в самых крайних случая, летальность. Это называется негативных генетических взаимодействия и обычно является признаком того, что два гены действуют в параллельных биологические пути. 2 двойной фенотипом мутанта лучше чем ожидаемый сочетание родительского фенотипов, также известный как позитивного взаимодействия генетические. Позитивное взаимодействие генетических особенно интересно, потому что она показывает, что эти гены работают в том же процессе. Два взаимодействующих положительно гены имеют три возможных отношений: мутантный ген может вверх регулировать экспрессии гена, в параллельные пути, двух генов может работать согласованно в рамках же путь вниз по течению друг друга или два гены кодировать белки, которые взаимодействуют непосредственно друг с другом. Таким образом позитивные генетических взаимодействий может использоваться для сопоставления гена регулирующих узлов и классифицировать uncharacterized генов в биохимические пути7,,8.
Подавитель это мутации, которые могут облегчить болезни фенотип мутации гена другой, обычно представляющий позитивного генетических взаимодействия между двумя генами9,10. Подавитель мутации на различных локус, мутации, которые они подавляют известны как extragenic супрессоров. Они особенно ценны в изучении нежизнеспособных генетические мутации, синтетически спасать смертоносных фенотип (также известный как эффект Лазаря)11. Они также имеют потенциал терапевтического применения в лечении наследственных заболеваний12,13.
По всем этим причинам выявление подавитель мутаций в различных модельных организмов широко использовались для облегчения нашего понимания различных биохимических pathways14,,1516. Скрининг для перенапряжения обычно основывается на фенотип мутации в вопрос и требует проведения случайных мутагенеза изолировать мутации, которые облегчат фенотипа. Почти все модели организмов создали методы случайного мутагенеза. Например N-этил N-Нитрозомочевина (ENU) и ethylmethanesulfonate (EMS), два мутагенов, которые способны индуцировать точечные мутации в ДНК, широко используются в различных моделях мышей17,18,19 от бактерий . Кроме того хлорид марганца уже давно используется в дрожжи для марганца катиона способностью ингибировать ДНК ремонт пути20. Другой распространенный подход — УФ индуцированного мутагенеза, который генерирует генома общесистемной мутагенных пиримидина димеры21,22.
Хотя использование химического мутагенеза для выявления мутаций подавитель был популярен, метод имеет много недостатков, в том числе использование опасных химических веществ, крайне непостоянны успех ставки и введение дополнительных смешанных переменных представлено негативные побочные эффекты мутаген несколько клеточных процессов23,24. Кроме того химический мутагенез часто вызывает несколько мутаций в геном, который добавляет сложности использования генетических и последовательности методов для определения точного мутации, которая наделяет подавитель фенотип организма25.
Для устранения недостатков нынешних подходов мутагенеза, мы представляем метод экран для спонтанного подавитель мутации в деления дрожжей, которые не полагаться на любой мутагены или удаление библиотеки. Этот метод изолирует Подавители через пробирного позитивного выбора. Принцип этого метода на основе роста преимущество мутировавших супрессорной субпопуляции в жидкой культуры, который может контролироваться читатель автоматизированной пластины. Спаривание и мейоз используются только если хотите очистить генетический фон или подтвердить наличие Моногенные аллели супрессоров до всего генома. Если подавление фенотип вызвана одной мутации, подавитель фенотип будет отделять 2:2 после Опылив с родительского штаммов. Подавитель мутации могут быть определены с помощью всего генома. Мы предлагаем, что этот метод применим для скрининга перенапряжения в всех микроорганизмов, которые могут расти в большой численностью населения в жидком культуры.
Протокол, описанные здесь представляет Роман и простой экран для спонтанного подавитель мутации обнаруживаемой через фенотипические восстановления мутаций, присвоении медленный рост дрожжей деления, фенотип, характерные для более чем 400 генов в S. pombe, функции многих из которых остается неизвестным2,32. Предыдущие методы взяли другие подходы к экран для подавитель мутации в микроорганизмов, включая использование мутагенов21, или применение изменения температуры в чувствительных к температуре мутант стола33. Напротив этот протокол показывает, что Фенотипическая восстановления происходит без дополнительного вмешательства экологических химической и подчеркивается преимущество фитнес подъем подавления мутаций со временем принимая за ресурсы, имеющиеся в жидкости культуры. Этот экран позволяет изоляции объездной Подавители или взаимодействия супрессоров, потому что он является эффективным для обеих функция потерь мутации, например elf1∆ или fal1∆ и точечные мутации как clr6-1, покуда мутантов продемонстрировать фитнес дефектов в жидких культуры.
Пока все восстановленные S штаммов, которые мы исследовали продемонстрировали различной степени фенотипические восстановления. Как обнаружил через генетических, восстановленные фенотип объясняется до одноэлементных генетических и является наследственным (примеры показаны на рисунке 2). Это один из наиболее значительных преимуществ этого метода по сравнению с химической основе или на основе УФ подавитель экраны, которые часто ориентированы на нескольких локусов генома. Это часто можно наблюдать одну или две колонии, восстановленные из 16 колоний в штамм (около 10%) в течение недели. Однако мы заметили, что некоторые мутантов, такие как потеря функции Rrp6, exosome конкретного подразделения, никогда не восстановить темпы роста почти одичал типа наблюдается в elf1Δ клетки31. Вполне вероятно, что функция Rrp6 может только частично компенсируется супрессоров, в отличие от функции других мутантов испытания, включая fal1∆, который был показан причинять серьезный дефект meiotic через свою важную функцию регулирования сплайсинга34. Мы считаем, что альтернативные супрессор, методы фильтрации будет зависеть от той же проблемой, когда yfg имеет уникальный, несъемными ролей в рост клеток.
Перед выполнением геномные последовательности, является оптимальным для обратно крест фенотипически восстановленные колоний, определены от плиты читателя, с родительского штаммов очистить генетический фон и получения биологических реплицирует. Кроме того глубоко всего генома определяет сотни единичных нуклеотидных изменений, большинство из которых не являются идентичными между биологической реплицирует, которые имеют мало интереса для скрининга. Например мы обнаружили в общей сложности 660 геномных изменений во всех трех хромосом между двумя elf1Δ P и пять различных штаммов S (Рисунок 3). Мы не наблюдали часто идентичны мутаций между виртуализированного биологического реплицирует каждого штамма, предполагая, что новые мутации могут возникать во время культивирования клеток elf1Δ до строительства геномная библиотека или случайные ошибки могут быть представил во время строительства библиотеки и последовательности. Следовательно изолируя мутации, которые согласуются через биологические реплицирует является важным аспектом в успешной идентификации супрессоров, используя всего генома.
Мы определили и подтвердил два перенапряжения в регионах компакт-диски в пяти виртуализированного S штаммов. Хотя в S-A1 и S-A2 штаммы были обнаружены мутации в SPBPJ4664.02 , маловероятно, что SPBPJ4664.02 является допустимым супрессор, потому что S-A1 и S-A2 не содержит супрессорной на же ген, как они не дополняют друг друга ( данные не показаны). Мы также не подтвердить rli1 в S-A3, который сделал не совместного разделения с фенотипом S при backcrossed с elf1Δ. Кроме того мы нашли специфических мутаций в регионах-кодирования в S-A1, S-A2 и S-А3. Вполне возможно, что эти измененные некодирующих геномной регионов облегчить elf1Δ фенотип, который будет рассматриваться в наших будущих исследований. По сравнению с традиционными методами например пробирного связь, которая может занять годы для сопоставления генетической мутации, мы определили два перенапряжения в течение двух месяцев после подтверждения, что Моногенные элемент вызвал S фенотип. С быстрым развитием технологии всего генома мы настроены оптимистично, что этот метод будет более эффективным для определения последовательного генетические мутации в обозримом будущем.
Таким образом этот протокол предоставляет пошаговые инструкции для успешного выявления мутации подавитель для любого гена интереса с дефектом медленно растущих в жидком культуры. Простота этот assay позволяет для крупномасштабных показ нескольких генетический фон интерес с мало практической подготовки. Есть комната для дальнейшей автоматизации процесса с помощью робота жидкого обработки для выполнения ежедневных разведениях. Так как лаборатория манипуляция микроорганизмов неизбежно требует роста культур в жидкой среде, процесс, который по своей сути селективный для фитнеса, мы предлагаем, что этот протокол может широко применяется для других организмов модель большого населения, таких как бактерии и другие виды дрожжей.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана, Национальный институт Генеральной медицинских наук, гранты 1R15GM119105-01 для К.Ж Мы благодарим всех рецензентов для проницательные комментарии. Мы также благодарим Джеймса Такер, Алисия Андерсон, Элизабет Black и Глен Маррс для обсуждения и комментариев на этой рукописи.
Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100×15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range |
Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
Sterile workspace and burners | |||
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |