Sidérophore High-throughput Screening d’échantillons environnementaux : planter la rhizosphère sols, sols en vrac et tissus
Summary
Nous présentons un protocole pour le dépistage rapide des échantillons environnementaux pour potentiel de sidérophores contribuant à la biodisponibilité des micronutriments et de chiffre d’affaires dans les systèmes terrestres.
Abstract
Sidérophores (métal de faible poids moléculaire composés de chélation) sont importantes dans divers phénomène écologique allant de fer (Fe) cycles biogéochimiques dans les sols, à concurrence de pathogène, stimulation de la croissance végétale et croix-Royaume de signalisation. En outre, les sidérophores sont également d’intérêt commercial dans la biolixiviation et bioweathering de minerais et minéraux métallifères. D’évaluer quantitativement la production de sidérophores dans des échantillons complexes de manière rapide, rentable et solide est essentiel pour identifier les aspects importants des ramifications écologiques de l’activité de sidérophores, y compris, roman sidérophore produisant des microbes. La méthode présentée ici a été développée pour évaluer l’activité de sidérophores des communautés en-tact microbiome, dans des échantillons environnementaux, tels que les tissus de sol ou de la plante. Les échantillons ont été homogénéisés et dilués dans un milieu modifié de M9 (sans Fe) et des cultures d’enrichissement ont été incubées pendant 3 jours. La production de sidérophores a été évaluée dans des échantillons à 24, 48 et 72 heures (h) à l’aide d’une microplaque de 96 puits nouvelle CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar dosage, une adaptation de la méthode colorimétrique traditionnellement pénible et fastidieuse de l’évaluation de sidérophores activité, effectuée sur l’individu cultivé des souches microbiennes. Nous avons appliqué notre méthode pour 4 différents génotypes/lignes de blé (Triticum aestivum L.), y compris Lewjain, Madsen, PI561725 et PI561727 communément cultivées à l’intérieur du Nord-Ouest du Pacifique. La production de sidérophores a été clairement affectée par le génotype de blé et dans les types spécifiques de tissus végétaux observés. Avec succès, nous avons utilisé notre méthode pour dépister rapidement l’influence du génotype de la plante sur la production de sidérophores, des fonctions essentielles dans les écosystèmes terrestres et aquatiques. Nous avons produit plusieurs répétitions techniques, ce qui donne des différences statistiques très fiables dans les sols et dans les tissus végétaux. Ce qui est important, les résultats montrent que la méthode proposée permet d’étudier rapidement la production de sidérophores dans des échantillons complexes avec un degré élevé de fiabilité, d’une manière qui permet aux communautés d’être préservés pour des travaux postérieurs à identifier les taxons et les gènes fonctionnels.
Introduction
Les sidérophores sont des biomolécules importantes impliquées principalement dans la chélation du fer pour la biodisponibilité, mais avec un large éventail de fins supplémentaires dans les écosystèmes terrestres et aquatiques allant de microbienne quorum sensing, signalisation à microbiennes plantes-hôtes, stimulation de la croissance végétale, coopération et concurrence au sein des communautés microbiennes complexes1,2. Sidérophores peuvent être classées selon leurs sites actifs et ses caractéristiques structurelles, créer quatre types de base : carboxylate, hydroxamate, catécholate et contrastées types3,4. De nombreux micro-organismes sont capables d’excréter plusieurs types de sidérophores5 et dans les communautés complexes, une grande majorité des organismes biosynthétiser les récepteurs membranaires pour permettre l’absorption d’une variété encore plus large de sidérophores1, 6. Des travaux récents indiquent que les sidérophores sont particulièrement importants à l’échelon communautaire et même dans les communications inter-royaume et biogéochimiques transferts7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) a été utilisé depuis plus de 30 ans comme agent chélateur pour lier le fer (Fe) de telle sorte qu’addition de ligands (c.-à-d. les sidérophores) peut entraîner la dissociation du complexe Fe-CAS, créant un changement de couleur facilement identifiables dans le milieu 12. lorsque des CAS the est lié avec Fe, le colorant apparaît comme une couleur bleue royal, et comme le complexe Fe-CAS se dissocie, le milieu change de couleur selon le type de ligand utilisée pour piéger le Fe13. Le milieu initial, base liquide créé par Schwyn et Neilands en 1987, a été modifiée à plusieurs égards à accueillir l’évolution microbienne cibles14, habitudes de croissance et limites15, ainsi que divers métaux en dehors de la Fe, y compris en aluminium, manganèse, cobalt, nickel cadmium, lithium, zinc16, cuivre17et même l’arsenic18.
De nombreux agents pathogènes humains, aussi bien comme plantes micro-organismes favorisant la croissance (PGPM) ont été identifiés comme organismes producteurs sidérophore3,19,20et important rhizosphère et endophyte PGPM souvent tester résultats positifs pour la production de sidérophores4. La méthode traditionnelle axée sur les Fe liquide a été adaptée pour microplaques essais des isolats en culture pour la production de sidérophores21. Toutefois, ces techniques ne reconnaissent pas l’importance de la communauté microbienne dans son ensemble (le microbiome), en coopération et règlement potentiel de production de sidérophores dans les sols et les plantes systèmes22. Pour cette raison, nous avons développé une évaluation au niveau communautaire haut débit de production de sidérophores d’un environnement donné, basé sur l’analyse de CAS traditionnel, mais avec la réplication, la facilité de la mesure, la fiabilité et la répétabilité dans une microplaque dosage.
Dans cette étude, une analyse de CAS-Fe rentable et à haut débit pour détecter la production de sidérophores est présentée afin d’évaluer l’enrichissement de la production de sidérophores d’échantillons complexes (c.-à-d. des homogénats de sol et plante de tissu). En vrac, couplage lâche et étroitement lié aux rhizosphère (en fonction de la façon dont le sol était lié à la racine) ont été obtenus avec grain, shoot et tissus racinaires de quatre génotypes distincts de blé (Triticum aestivum L.) : Lewjain, Madsen, PI561725, et PI561727. Il a été émis l’hypothèse que les différences fondamentales entre les génotypes de blé pourrait entraîner des différences dans le recrutement et la sélection des sidérophores produisant des communautés. Un intérêt particulier est la différence entre des communautés microbiennes associées à la ligne isogénique de PI561725, qui est tolérant en aluminium car il possède ALMT1 (aluminium-activé Malate transporteur 1), par rapport à l’aluminium PI561727 isogénique ligne sensibles, qui possède une forme sensible non-aluminium du gène, almt123,24,25,26. L’objectif principal de l’étude était de développer une méthode simple et rapide d’évaluer quantitativement la production de sidérophores dans des cultures d’enrichissement sidérophore de types d’échantillons complexes tout en préservant les cultures pour les travaux futurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principal résultat de ce travail est la production d’une nouvelle méthodologie qui permet d’enrichir rapidement pour sidérophore produisant des microbes quand on mesure quantitativement sidérophore/activité de production dans les échantillons environnementaux. La méthode est rapide, simple et rentable, et les résultats montrent comment il peut être utilisé pour détecter les activités sidérophore de types d’échantillons complexes et nouveaux (p. ex.., tissus de sol et les plantes). Le proto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Kalyani Muhunthan d’assistance dans les procédures de laboratoire, Lee Opdahl pour la récolte de blé génotype, le Washington State raisin Concord Research Council et la Washington State University Center pour soutenir l’Agriculture et Ressources naturelles pour un BIOAg subvention pour soutenir ce travail. Un financement supplémentaire a été fourni par l’USDA/NIFA à travers projet Hatch 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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