चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश के उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना का मात्रात्मक विश्लेषण-चूहों अनुरेखण
Summary
हम एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करने के लिए देर से मंच के सेलुलर संरचना की विशेषता मूरीन atherosclerotic घावों के व्यवस्थित तरीके सहित पशु विच्छेदन, ऊतक embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनियों का विश्लेषण से atheroprone चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश अनुरेखण चूहों.
Abstract
atherosclerosis दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण बना हुआ है और, अनगिनत पूर्व नैदानिक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्यों का वर्णन अध्ययन के बावजूद, उपंयास हस्तक्षेप मायावी बनी हुई है । यह संभावना है, हिस्से में, आनुवंशिक जोड़तोड़ या atherosclerosis के विकास पर औषधीय उपचार के प्रभाव की जांच के बजाय स्थापित रोग से पूर्व नैदानिक रोकथाम मॉडल पर निर्भरता के लिए । इसके अलावा, इन अध्ययनों के परिणाम अक्सर क्योंकि सतही घाव का विश्लेषण और घाव कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन की कमी के उपयोग के अनुरूप हैं । इन स्थानांतरीय बाधाओं को दूर करने में मदद करने के लिए, हम हस्तक्षेप मॉडल है कि इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला और संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा एक एकल सेल स्तर पर सेलुलर संरचना में परिवर्तन की जांच को रोजगार पर एक वृद्धि की निर्भरता का प्रस्ताव । इस अंत करने के लिए, हम पशु विच्छेदन के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण, embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनी के घावों के परिमाणन सहित एक मूरीन हस्तक्षेप मॉडल में एक ख्यात चिकित्सकीय एजेंट परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इसके अलावा, देर से चरण atherosclerotic घावों के भीतर कोशिकाओं की लक्षणप्ररूपी विविधता के कारण, हम सेल विशेष का उपयोग करने के महत्व का वर्णन, inducible वंश अनुरेखण माउस सिस्टम और कैसे इस के निष्पक्ष लक्षण वर्णन के लिए डिप्लोमेसी किया जा सकता है atherosclerotic घाव सेल आबादी । साथ में, इन रणनीतियों संवहनी जीव की सहायता के लिए और अधिक सही मॉडल चिकित्सीय हस्तक्षेप और atherosclerotic रोग का विश्लेषण और उंमीद है कि नैदानिक परीक्षणों में सफलता की एक उच्च दर में अनुवाद करेंगे ।
Introduction
atherosclerosis रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर में कोरोनरी धमनी रोग, परिधीय धमनी रोगों, और स्ट्रोक के बहुमत के प्रमुख कारण है । देर से मंच कोरोनरी atherosclerosis विश्व जनसंख्या मृत्यु दर1,2के लगभग 16% के लिए मायोकार्डियल अतिक्रमण लेखांकन सहित गंभीर जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सार्वजनिक स्वास्थ्य पर अपने विनाशकारी प्रभाव के कारण, पर्याप्त प्रयास atherosclerosis प्रगति ड्राइविंग तंत्र को समझने के लिए किया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों का विकास । फिर भी, अनुमोदन की संभावना (loa) हृदय रोग के लिए नैदानिक परीक्षणों की दर सबसे कम जब अंय नैदानिक क्षेत्रों के साथ तुलना में है (केवल ८.७% चरण के लिए मैं)3। इस भाग में कई बाधाओं से समझाया जा सकता है कि atherosclerosis अपने लगभग सर्वव्यापी प्रकृति सहित कुशल औषधि विकास के लिए बन गया है, चिकित्सकीय-मूक प्रगति, और महत्वपूर्ण रोग heterogeneity । इसके अलावा, पूर्वनैदानिक पशु अध्ययन के सबऑप्टिमल डिजाइन भी नैदानिक अनुवाद में सफलता की कमी के लिए जिंमेदार हो सकता है । विशेष रूप से, हमें विश्वास है कि यह हस्तक्षेप अध्ययन जब भी संभव चिकित्सकीय रणनीतियों की प्रभावकारिता की जांच लागू करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, भाग्य मानचित्रण और phenotyping द्वारा देर से मंच atherosclerotic घाव सेलुलर संरचना के उन्नत लक्षण वर्णन सहित घाव विश्लेषण के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है.
atherosclerosis के विशाल बहुमत atherosclerosis की रोकथाम के मॉडल पर ध्यान केंद्रित दवा उपचार या जीन हेरफेर से मिलकर (नॉकआउट या दस्तक में) स्वस्थ युवा चूहों में, रोग दीक्षा और प्रगति से पहले. इन अध्ययनों से जीन और संकेतन अणुओं की एक बड़ी संख्या का पर्दाफाश किया है कि atherosclerosis विकास में एक भूमिका निभाते हैं । हालांकि, इन लक्ष्यों में से अधिकांश मानव में कुशल चिकित्सा के लिए अनुवाद करने में विफल रहा । वास्तव में, यह प्रभाव बहिर्वेशन करने के लिए मुश्किल है एक थेरेपी उन्नत atherosclerotic घावों के साथ बुजुर्ग रोगियों के लिए स्वस्थ युवा चूहों पर है. इस प्रकार, पूर्व नैदानिक प्रायोगिक पाइपलाइन में हस्तक्षेप अध्ययनों के कार्यान्वयन की संभावना एक नई चिकित्सकीय की प्रासंगिकता और प्रभावकारिता का एक और अधिक सटीक चित्रण प्रदान करता है. विचार एक रोकथाम4,5,6 या हस्तक्षेप रणनीति7को रोजगार जब समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन इंटरल्यूकिन-1β (आईएल-1β) बाधा के चर्यजनक अपसारी प्रभाव द्वारा समर्थित है । रोकथाम और हस्तक्षेप के बीच मतभेद अध्ययन सुझाव है कि विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं atherosclerosis विकास के विभिन्न चरणों में होते हैं और तथ्य यह है कि रोकथाम के अध्ययन की संभावना नैदानिक परिदृश्य मॉडल के लिए अपर्याप्त हैं पर प्रकाश डाला गया पर्याप्त.
अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ने हाल ही में एक वैज्ञानिक उचित प्रयोगात्मक डिजाइन, प्रक्रियात्मक मानकीकरण, विश्लेषण, और पशु atherosclerosis अध्ययन की रिपोर्टिंग के लिए सिफारिशों का ब्यौरा विवरण प्रकाशित8। यह लाभ और प्रमुख तकनीक क्षेत्र में इस्तेमाल की सीमाओं पर प्रकाश डाला गया । उदाहरण के लिए, महाधमनी के एन चेहरा सूडान चतुर्थ धुंधला अक्सर एक पहले पढ़ा-बाहर के रूप में किया जाता है । हालांकि एन फेस सूडान चतुर्थ लिपिड जमाव के दाग वैश्विक पट्टिका बोझ के आकलन के लिए एक उपयुक्त तरीका है, यह और अधिक उन्नत देर चरण घावों से प्रारंभिक चरण फैटी लकीर घावों भेद करने में असमर्थ है । जैसे, एन चेहरे धुंधला की व्याख्या अक्सर अस्पष्ट और सतही9है । ऊतक पार वर्गों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण सुघड़ मापदंडों पोत, घाव, और लुमेन आकार और घाव स्थिरता के सूचकों के परिमाणन का उपयोग कर एक प्रयोग के प्रभाव की एक अधिक सटीक समझ प्रदान करता है ।
अंत में, मानव हिस्टोथोलॉजी अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि सेलुलर संरचना घाव के आकार से ही टूटना का एक बेहतर कारक है, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में खराब घावों के साथ (एसएमसी) और मैक्रोफेज में अमीर10टूटना करने के लिए अतिसंवेदनशील जा रहा है, 11. इन टिप्पणियों के मार्कर के लिए अभिरंजक के आधार पर सेल की पहचान के लिए इस्तेमाल किया (यानी, एसएमसी और LGALS3 या मैक्रोफेज के लिए CD68 के लिए ACTA2) थे । हालांकि, इन मार्करों की अभिव्यक्ति कड़ाई से एसएमसी, endothelial कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं12सहित कई प्रजातियों के plasticity के कारण atherosclerotic घावों में एक भी कोशिका प्रकार के लिए प्रतिबंधित नहीं है । विशेष रूप से, atherosclerotic घाव के भीतर एसएमसी की स्पष्ट पहचान वस्तुतः असंभव था क्योंकि इन कोशिकाओं की संपत्ति के dedifferentiate और उनके वंश विशेष मार्कर जीन दमन करने के लिए पिछले एक दशक तक (एक प्रक्रिया के रूप में संदर्भित लक्षणप्ररूपी स्विचन) घायल या रोगग्रस्त जहाजों में13. एसएमसी पहचान में इस सीमा के विकास से दरकिनार कर दिया गया है वंश अनुरेखण7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. यह स्थाई रूप से लेबलिंग के होते है एसएमसी और उनकी संतान को उनके भाग्य और atherosclerosis प्रगति के दौरान लक्षणप्ररूपी विकास को ट्रैक करने के लिए एसएमसी-विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित cre recombinase की अभिव्यक्ति का एक संयोजन का उपयोग करके (यानी, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 और, SM22α14,16) और रिपोर्टरों के सक्रियण (उदा., फ्लोरोसेंट प्रोटीन, β-galactosidase) [bentzon और majesky में समीक्षित २०१८27] । पहली अध्ययन में से एक में एसएमसी वंश पता लगाने के बाहर काम करना भ्रूणविज्ञान सेटिंग, speer एट अल.14 प्रदान की सबूत है कि एसएमसी उनके phenotype मिलाना और संवहन के दौरान chondrogenic कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते है का उपयोग करके एक SM22α cre R26R lacz वंश अनुरेखण मॉडल । हालांकि इन अध्ययनों ने एसएमसी वंश अनुरेखण का बीड़ा उठाया है, वे आंशिक रूप से गोलमोल थे कि किसी भी गैर-एसएमसी व्यक्त SM22α रोग की स्थापना में रिपोर्टर द्वारा चिह्नित किया जाएगा । इस सीमा के विकास और tamoxifen के उपयोग से नजरअंदाज कर दिया गया है-inducible cre ERT/loxp सेल लेबलिंग के एक अस्थायी नियंत्रण की अनुमति. सेल लेबलिंग विशेष रूप से tamoxifen वितरण के दौरान होता है और सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर tamoxifen जोखिम के समय में cre ईआरटी अभिव्यक्ति ड्राइविंग व्यक्त करने के लिए प्रतिबंधित किया जाएगा, में cre सक्रिय करने के वैकल्पिक सेल प्रकार के ट्रेसिंग से परहेज रोग प्रगति की स्थापना. atherosclerosis में एसएमसी के वंश अनुरेखण के लिए, tamoxifen-inducible Myh11-cre/ERT2 फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ जुड़े transgene (eyfp7,15,17,18 , 21, mtmg19,25, कंजेट्टी20,22,23 क्लोनी विस्तार अध्ययन के लिए) एक उल्लेखनीय दक्षता और एसएमसी लेबलिंग में विशिष्टता का प्रदर्शन किया है और हाल के अध्ययनों में atherosclerotic घावों में भाग्य नक्शा एसएमसी आबादी के लिए इस्तेमाल किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इन अध्ययनों से पता चला है कि: 1) उन्नत atherosclerotic घावों के भीतर एसएमसी के ८०% किसी भी पारंपरिक एसएमसी मार्करों (ACTA2, MYH11) immunohistological विश्लेषण में इस्तेमाल व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए वंश अनुरेखण के बिना ने किया गया होता 17; 2) मैक्रोफेज मार्कर या मध्योतक स्टेम सेल मार्कर सहित वैकल्पिक सेल प्रकार के एसएमसी एक्सप्रेस मार्कर के सबसेट16,17,19; और 3) एसएमसी निवेश और ओलिगोक्लोनल विस्तार और एसएमसी क्लोन द्वारा atherosclerotic घाव आबाद phenotypically अलग आबादी20,23के लिए संक्रमण के लिए plasticity बनाए रखने के । संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, यह अब स्पष्ट है कि चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं atherosclerotic घावों में एक उल्लेखनीय लक्षणप्ररूपी विविधता मौजूद है और उनके लक्षणप्ररूपी संक्रमण की प्रकृति पर निर्भर करता है घाव रोगजनन पर फायदेमंद या हानिकारक भूमिकाओं हो सकता है. इन खोजों के लिए एक उल्लेखनीय नए चिकित्सकीय एवेन्यू का प्रतिनिधित्व एसएमसी athero को लक्षित करने के लिए देर से चरण atherosclerosis में लक्षणप्ररूपी संक्रमण को बढ़ावा देने.
इस के साथ साथ, हम देर से मंच का विश्लेषण करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव मूरीन atherosclerotic घावों के लिए व्यवस्थित तरीके सहित पशु विच्छेदन, embedding, sectioning, धुंधला, और बाहु-शीर्ष धमनी घावों के परिमाणन । के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए interleukin-1β निषेध पर एसएमसी भाग्य और phenotype, हम इस्तेमाल किया एसएमसी वंश अनुरेखण apoe-/ चूहों एक विरोधी IL1β एंटीबॉडी या isotype-मिलान igg नियंत्रण के साप्ताहिक इंजेक्शन प्राप्त करने से पहले 18 सप्ताह के लिए एक पश्चिमी आहार खिलाया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुसंधान और atherosclerosis के अध्ययन में तकनीकी प्रगति के दशकों के बावजूद, क्षेत्र नैदानिक चिकित्सा३४,३५वैज्ञानिक निष्कर्षों का अनुवाद करने का एक निराशाजनक इतिहास है । इस घटना को भाग मे?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जीवविज्ञान इमेजिंग के लिए केंद्र धंयवाद (nih 1s10od019973-01 द्वारा समर्थित) पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में उनकी सहायता के लिए । इस काम के द्वारा समर्थित किया गया है द्वारा समर्थित है वैज्ञानिक विकास अनुदान 15sdg25860021 अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन से डीजी r.a.b. nih अनुदान F30 HL136188 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
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