Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels
Summary
Proteoom karakterisering van oogbeschadigingen en/of microvasculaire bedden is cruciaal voor diepgaand inzicht in de vele oogbeschadigingen en/of pathologieën bij de mens. Deze studie toont aan dat een doeltreffende, snelle en robuuste methode voor eiwit extractie en bereiding van de monsters van kleine bloedvaten met de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders als model vaartuigen voor proteomics massa spectrometrie-gebaseerde analyses.
Abstract
Het gebruik van geïsoleerde oogbeschadigingen en/of bloedvaten in vitro te ontcijferen van de pathofysiologische staat van het oog met behulp van geavanceerde technologische benaderingen heeft ons begrip van bepaalde ziekten sterk uitgebreid. De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde proteomics heeft ontpopt als een krachtig instrument te ontrafelen van veranderingen in de moleculaire mechanismen en eiwit signalering trajecten in de vasculaire bedden in gezondheid en ziekte. Monster voorbereiding stappen voorafgaand aan MS analyses zijn echter cruciaal om reproduceerbare resultaten en diepgaande opheldering van de complexe Proteoom te verkrijgen. Dit is vooral belangrijk voor bereiding van oogbeschadigingen en/of microvessels, waar de hoeveelheid monster beschikbaar voor analyses is vaak beperkt en dus een uitdaging voor optimale eiwit extractie. Dit artikel probeert te zorgen voor een efficiënte, snelle en robuuste protocol voor de bereiding van de monsters uit een voorbeeldige retrobulbaire oogbeschadigingen en/of vasculaire bed de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders in dienst. De huidige methode richt zich op eiwit extractie procedures van zowel de bovendrijvende substantie en de pellet van het monster na homogenisering, sample reiniging met centrifugaal filter implantaten vóór eendimensionale gel elektroforese en peptide zuivering stappen voor het label-vrije kwantificering in een vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-lineaire ion trap-Orbitrap MS systeem. Hoewel deze methode is speciaal ontwikkeld voor proteomics analyses van oogbeschadigingen en/of microvessels, hebben we ook een overtuigend bewijs dat het kan ook gemakkelijk aangewend worden voor andere monsters van weefsel gebaseerde verstrekt.
Introduction
De vooruitgang op het gebied van proteomics, welke vergunningen geïntegreerd en onovertroffen gegevens collectie macht, heeft sterk hervormd ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan bepaalde ziekten zo goed zoals in als gevolg van de fysiologische toestand van een bepaalde cel bevolking of weefsel1,2,3,4. Proteomics heeft ook bewezen als een belangrijk platform in ophthalmic onderzoek wegens hun gevoeligheid en onbevooroordeelde analyse van verschillende oogbeschadigingen en/of monsters, dat vergemakkelijkt de identificatie van potentiële ziekte markers voor de uiteindelijke diagnose en prognose, als blijkt elegant door vele studies in de afgelopen jaren, waaronder enkele van onze1,5,6,7,8,9,10. Het is echter vaak moeilijk te verkrijgen van menselijke specimens voor proteomic analyses ethische redenen, vooral gezien de behoefte aan controle materiaal uit gezonde individuen voor betrouwbare vergelijkende analyses. Aan de andere kant, is het ook uitdagend om te verkrijgen van voldoende hoeveelheid monsters voor optimale en betrouwbare massaspectrometrische analyses. Dit is met name cruciaal voor massa-beperkte biologische materialen zoals de micro-bloedvaten van het oog. Een dergelijke grote retrobulbaire bloed vaartuig dat cruciale rol in de regulatie van de bloedstroom oogbeschadigingen en/of speelt is de korte posterieure Ciliaire slagader (sPCA). Elke verstoring of afwijkingen in dit vasculaire bed kunnen leiden tot ernstige klinische gevolgen, die tot de pathogenese van diverse zicht-bedreigende ziekten, zoals glaucoom en nonarteritic anterieure ischemische optische neuropathie (NAION)11 leiden kunnen , 12. er is echter een gebrek aan studies ophelderen van de Proteoom veranderingen in dit arteriële bed als gevolg van de bovengenoemde nadelen. Daarom, in de afgelopen jaren het huis zwijn (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) heeft ontpopt als een goede diermodel in ophthalmic onderzoek als gevolg van de hoge morfologische en fylogenetische gelijkenissen tussen mens en varkens13, 14,,15. Varkens oogbeschadigingen en/of monsters zijn eenvoudig verkrijgbaar en bovenal zijn meer accurate weergave van menselijke weefsels.
Gezien de belangrijke rol van deze bloedvaten in het oog, evenals het gebrek aan methodologie verzorgd voor efficiënte eiwit extractie en analyses van deze microvessels, hebben wij eerder het proteoom van de varkens sPCA met behulp van een in-house gekenmerkt protocol dat in de identificatie van een groot aantal proteïnen16 resulteerde. Op basis van deze studie, we verder geoptimaliseerd en diepgaand beschreven onze methodologie in dit artikel, waarmee Proteoom analyse van minieme hoeveelheden van monsters met behulp van de varkens sPCA als model weefsel. Zij het belangrijkste doel van deze studie was om een MS-compatibele methodologie voor massa-limited oogbeschadigingen en/of bloedvaten, hebben wij aanzienlijke experimenteel bewijs dat de beschreven werkstroom ook worden in grote lijnen op verschillende monsters van weefsel gebaseerde toegepast kan verstrekt.
Het is voorzag dat deze werkstroom dienstig zijn voor de voorbereiding van hoogwaardige MS-compatibele monsters van kleine hoeveelheden materialen voor uitgebreide Proteoom analyse zal worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uitgebreide Proteoom profilering van een breed scala aan oogbeschadigingen en/of monsters is een belangrijke en onmisbare eerste stap het ophelderen van de moleculaire mechanismen en signaalroutes betrokken bij gezondheid en ziekte. Om hoogwaardige gegevens te verkrijgen en te garanderen van de reproduceerbaarheid van de resultaten van deze analyses, de voorgaande monster voorbereiding stappen zijn cruciaal, zoals benadrukt in een recensie door Mandal et al., die diepgaand besproken de Voorbeeldprocedures voor de verwerk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam wordt ondersteund door de interne Universiteit onderzoeksfinanciering (Stufe 1) van het universitair medisch centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz en een beurs van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Riferimenti
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
