Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen
Summary
Proteome Charakterisierung der okulären mikrovaskuläre Betten ist von zentraler Bedeutung für tiefes Verständnis für viele okulären Erkrankungen beim Menschen. Diese Studie zeigt eine effektive, schnelle und robuste Methode zur Proteingewinnung und Probenvorbereitung aus kleinen Blutgefäßen beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien als Modell-Schiffe für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen.
Abstract
Die Verwendung von isolierten okulären Blutgefäße in vitro zu entschlüsseln, die pathophysiologischen Zustand des Auges mit fortgeschrittenen technologischen Ansätzen hat unser Verständnis bestimmter Krankheiten erheblich erweitert. Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics entstanden als ein mächtiges Werkzeug, um Änderungen in den molekularen Mechanismen und Protein Signalwege in der vaskulären Betten in Gesundheit und Krankheit zu entwirren. Probe Vorbereitungsschritte vor MS-Analysen sind jedoch entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse und ausführliche Aufklärung des komplexen Proteome zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Vorbereitung der okulären Mikrogefäßen, wo die Menge der Probe für Analysen zur Verfügung ist oft begrenzt und somit eine Herausforderung für optimale Proteingewinnung. Dieser Artikel ist bestrebt, eine effiziente, schnelle und robuste Protokoll für die Probenvorbereitung von eine beispielhafte retrobulbären okuläre vaskulären Bett beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien anzubieten. Die vorliegende Methode konzentriert sich auf Protein Extraktionsverfahren aus dem überstand und Pellet der Probe nach der Homogenisierung, probieren mit zentrifugalen Filtergeräten vor eindimensionale Gel-Elektrophorese und Peptid-Reinigung Reinigung Schritte für die markierungsfreie Quantifizierung in eine flüssige Chromatographie-Elektrospray-Ionisation-lineare Ionenfalle-Orbitrap-MS-System. Obwohl diese Methode speziell für Proteomics Analysen der okulären Mikrogefäßen entwickelt wurde, haben wir auch überzeugende Beweise bereitgestellt, dass es auch ohne weiteres für andere Gewebe-basierten Proben eingesetzt werden kann.
Introduction
Die Weiterentwicklung im Bereich der Proteomik, welche Genehmigungen integriert und unübertroffen Daten Sammlung macht, hat unser Verständnis der molekularen Mechanismen, die bestimmte Erkrankungen ebenso wie in reflektiert stark revolutioniert die physiologischen Zustand einer bestimmten Zelle Bevölkerung oder Gewebe1,2,3,4. Proteomics auch erwies sich eine wichtige Plattform in Augenheilkunde aufgrund der Empfindlichkeit und unvoreingenommene Analyse der verschiedenen augenfälligen Proben, die Identifizierung von potenziellen Krankheitsmarker für eventuelle Diagnose und Prognose, als erleichtert belegt elegant durch viele Studien in den letzten Jahren, darunter auch einige von uns1,5,6,7,8,9,10. Allerdings ist es oft schwierig, humanen Proben für Proteomic Analysen aus ethischen Gründen, vor allem in Anbetracht der Notwendigkeit für Kontrollmaterial von gesunden Personen für zuverlässige vergleichende Analysen zu erhalten. Auf der anderen Seite ist es auch schwierig, genügend Proben für optimale und zuverlässige massenspektrometrische Analysen zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Masse zeitlich begrenzte biologische Materialien wie die Mikro-Blutgefäße des Auges. Eine solche große retrobulbären Blutgefäß, das spielt entscheidende Rolle bei der Regulierung der okulären Durchblutung ist die kurzen hinteren ciliary Arterie (sPCA). Jede Störung oder Anomalien in diesem Kreislauf Bett führen schwere klinische Auswirkungen die Pathogenese verschiedener Sicht lebensbedrohliche Krankheiten wie Glaukom und Nonarteritic anterior ischämische optische Neuropathie (NAION)11 führen kann , 12. Allerdings gibt es einen Mangel an Studien, die Aufklärung der Proteome Änderungen in diesem arteriellen Bett wegen der oben genannten Nachteile. Daher hat in den letzten Jahren die Haus Schwein (Sus Scrofa Domestica Linnaeus, 1758) ein gutes Tiermodell in Augenheilkunde aufgrund der hohen morphologischen und phylogenetischen Ähnlichkeiten zwischen Menschen und Schweinen13entwickelt, 14,15. Porcines okuläre Proben sind leicht zugänglich und vor allem sind genauere Darstellung der menschlichen Geweben.
In Anbetracht der wichtigen Rolle dieser Blutgefäße im Auge, sowie der Mangel an Methoden für effiziente Proteingewinnung und Analysen von diesen Mikrogefäßen gesorgt haben wir zuvor das Proteom von porcinen sPCA mit einer hauseigenen gekennzeichnet. Protokoll, das die Identifizierung der eine hohe Anzahl von Proteinen16geführt. Basierend auf dieser Studie, haben wir weiter optimiert und ausführlichen beschrieben unsere Methodik in diesem Artikel die Proteomanalyse von winzigen Mengen von Proben mit den Schweinen sPCA als Modell Gewebe ermöglicht. Wenn auch das Hauptziel dieser Studie war es, eine Frau-kompatible Methodik für Masse-limitierte okuläre Blutgefäße, haben wir erhebliche experimentelle Beweise bereitgestellt, dass der beschriebene Workflow auch weitgehend auf verschiedene Gewebe-basierten Proben angewendet werden kann.
Es ist vorgesehen, dass dieser Workflow instrumental für Herstellung von qualitativ hochwertigen MS-kompatible Proben von kleinen Mengen von Materialien für die umfassende Proteom-Analyse werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Umfassende Proteom Profilierung der unterschiedlichsten okuläre Proben ist eine wichtige und unverzichtbare erste Schritt, die molekularen Mechanismen und Signalwege verwickelt in Gesundheit und Krankheit aufzuklären. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus diesen Analysen zu gewährleisten, die vorhergehenden Probe Vorbereitungsschritte sind von entscheidender Bedeutung, wie hervorgehoben in einer Rezension von Mandal Et Al., die eingehende diskutiert die Probe Verarbe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam stützt sich auf die interne Universität Forschungsförderung (Stufe 1) aus dem Universitätsklinikum der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz und ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Riferimenti
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