הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels
Summary
פרוטאום אפיון של מיטות microvascular עינית היא גורלית להבנה מעמיקה של פתולוגיות עינית רבים בבני אדם. מחקר זה מדגים שיטה יעילה, מהירה, חזקה עבור חילוץ חלבון, הכנת הדוגמא של כלי דם קטנים העסקת חזירי קצר האחורי ciliary העורקים ככלים מודל עבור פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח.
Abstract
השימוש מבודד כלי הדם עינית במבחנה לפענח המדינה pathophysiological של העין באמצעות גישות טכנולוגי מתקדם התרחב באופן משמעותי את ההבנה שלנו של מחלות מסוימות. ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס פרוטאומיקס התפתחה כלי רב עוצמה כדי לפענח שינויים המנגנונים המולקולריים וחלבון איתות המסלולים על המיטות כלי הדם על בריאות ומחלה. עם זאת, דוגמת שלבי הכנה לפני ניתוחים MS מכריעים להשיג תוצאות לשחזור הבהרה מעמיקה של פרוטאום מורכבים זה חשוב במיוחד עבור הכנת microvessels עינית, הוא מוגבל בהן לפיכך, מציב אתגר לחילוץ חלבון אופטימום כמות הדגימה זמין עבור ניתוחים. מאמר זה במאמצים לספק פרוטוקול יעיל, מהיר וחזק עבור הכנת הדוגמא של retrobulbar למופת עינית וסקולרית מיטה העסקת חזירי קצר האחורי ciliary העורקים. שיטת הנוכחי מתמקד חלבון מיצוי ההליכים, החל תגובת שיקוע והן צניפה המדגם בעקבות המגון, לטעום ניקוי עם התקנים צנטריפוגלי מסנן לפני חד-ממדי ג’ל אלקטרופורזה וטיהור פפטיד פעולות עבור כימות ללא תווית בתוך מערכת MS כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray מלכודת יונים יינון-ליניארי-Orbitrap. למרות ששיטה זו פותחה במיוחד עבור פרוטאומיקס ניתוחים של microvessels עינית, סיפקנו גם ראיות משכנעות כי זה יכול גם להיות ברצון מועסק לדוגמאות אחרות מבוססות-רקמות.
Introduction
קידום בתחום פרוטאומיקס, אילו היתרים משולב, מתחרות כוח אוסף נתונים, יש מהפכה באופן משמעותי הבנתנו המנגנונים המולקולריים שבבסיס תנאים מסוימים המחלה גם כמו המשקף מצב פיזיולוגי של תא מסוים באוכלוסייה או רקמות1,2,3,4. פרוטאומיקס הוכיח גם את פלטפורמת חשוב במחקר אופטלמולוגיות בשל רגישות וניתוח לא משוחדת של דגימות עינית שונים פוריה זיהוי של סמני המחלה פוטנציאלי בסופו של דבר האבחנה והפרוגנוזה, כמו שמעידים באלגנטיות מחקרים רבים בשנים האחרונות, ובהם כמה שלנו1,5,6,7,8,9,10. זאת, לעתים קרובות קשה להשיג דגימות אנושי עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית מסיבות אתיות, במיוחד בהתחשב בצורך חומר שליטה אנשים בריאים עבור ניתוח השוואתי אמינים. מצד שני, זה גם מאתגר כדי לקבל כמות מספקת של הדוגמאות עבור ניתוחים spectrometric המוני ואמינה של האופטימלית. דבר זה חיוני במיוחד עבור מסה-מוגבלת חומרים ביולוגיים כגון מיקרו-הדם של העין. אחד כזה גדול retrobulbar כלי דם שמשחק תפקיד מרכזי בוויסות זרימת הדם עינית הוא העורק ciliary אחורי קצר (צער בעלי חיים). כל ההפרעות או חריגות במיטה כלי הדם הזה עלול לגרום השלכות קלינית חמורה, אשר יכול להוביל בפתוגנזה של כמה מחלות סכנת הראיה כגון גלאוקומה, nonarteritic anterior נוירופתיה אופטית איסכמי (NAION)11 , 12. עם זאת, יש מחסור של מחקרים שחקרתי את השינויים פרוטאום הטימב עורקי עקב החסרונות הנ ל. לכן, בשנים האחרונות חזיר הבית (Sus scrofa דומסטיקה ליניאוס, 1758) התפתחה מודל בעלי חיים במחקר אופטלמולוגיות בשל הדמיון מורפולוגיות ו פילוגנטי גבוהה בין בני אדם, חזירים13, 14,15. דוגמאות עינית חזירי זמינים בקלות והכי חשוב, הם ייצוג מדויק יותר של רקמות.
בהתחשב בתפקידו החשוב של אלו כלי דם בעיניים, כמו גם על מחסור של מתודולוגיה ששירתה עבור חילוץ יעיל חלבון וניתוחים מן microvessels הללו, אנו קודם לכן שאפיינו את פרוטאום של לאגודת צער בעלי חיים חזירי משתמש ללא צורך במיקור חוץ פרוטוקול שתוצאתם הזיהוי של מספר גבוה של חלבונים16. בהתבסס על מחקר זה, יש נוספים מיטוב ואנו תיאר מעמיק את המתודולוגיה שלנו במאמר זה, המאפשר ניתוח פרוטאום של כמויות זעירות של דגימות באמצעות לאגודת צער בעלי חיים חזירי כמו מודל רקמות. אמנם המטרה העיקרית של מחקר זה היה להקים מתודולוגיה התואמים ל- MS כלי הדם עינית מסה-מוגבלת, סיפקנו ניכר ראיות כי זרימת העבודה המתוארת ניתן גם בהרחבה להחיל על מדגמים שונים מבוססי רקמות.
זה נמצא שחזה כי זרימת עבודה זו תהיה אינסטרומנטלי הכנת איכותיים התואמים ל- MS דגימות כמויות קטנות של חומרים עבור ניתוחים פרוטאום מקיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטאום מקיף פרופיל של מגוון רחב של דוגמאות עינית היא צעד ראשון חשוב והכרחי התירי את המנגנונים המולקולריים ואת איתות המסלולים מעורבים מחלה ובריאות. על מנת לקבל נתונים באיכות גבוהה ולהבטיח את הפארמצבטית של התוצאות המתקבלות מניתוחי האלה, השלבים הקודמים של הכנת המדגם מכריעים, כפי שמודגש בס?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד ר Manicam נתמך על ידי פנימי אוניברסיטת מחקר מימון (Stufe 1) מהמרכז הרפואי באוניברסיטת את יוהנס גוטנברג אוניברסיטת מיינץ (mainz), מענק של פתוח (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Riferimenti
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
