Provberedning för Mass-Spektrometri-baserad proteomik analys av okulär microvesselsna
Summary
Proteomet karakterisering av okulär mikrovaskulära sängar är avgörande för fördjupad förståelse av många okulär sjukdomar hos människor. Denna studie visar en effektiv, snabb och robust metod för protein utvinning och provberedning från små blodkärl som sysselsätter den svin korta bakre ciliära artärer som modell fartyg för mass-spektrometri-baserad proteomik analyser.
Abstract
Användningen av isolerade okulära blodkärl in vitro-att dechiffrera det patofysiologiska tillståndet i ögat med hjälp av avancerade tekniska metoder har kraftigt expanderat vår förståelse av vissa sjukdomar. Masspektrometri (MS)-baserad proteomik har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg att nysta upp ändringar i molekylära mekanismer och protein signalering utbildningsavsnitt i vaskulär sängarna i hälsa och sjukdom. Provberedningssteg innan MS analyser är dock avgörande för att få reproducerbara resultat och djupgående utredning av det komplexa proteomet. Detta är särskilt viktigt för beredning av okulär microvesselsna, där mängden prov tillgängliga för analyser är ofta begränsat och således utgör en utmaning för optimal protein utvinning. Denna artikel strävar efter att tillhandahålla en effektiv, snabb och robust protokoll för provberedning från en exemplarisk retrobulbär okulär vaskulär säng sysselsätter den svin korta bakre ciliära artärer. De nuvarande metoden fokuserar på protein utvinning förfaranden från både supernatanten och pellets av provet efter homogenisering, prova rengöring med centrifugal filter enheter före endimensionell gel elektrofores och peptid rening steg för etikett-fri kvantifiering i ett flytande kromatografi-elektrospray jonisering-linjära ion trap-Orbitrap MS system. Även om denna metod har utvecklats specifikt för proteomik analys av okulär microvesselsna, har vi också gett övertygande bevis för att det kan även lätt användas för andra tissue-baserade prover.
Introduction
Befordran i fältet av proteomik, som möjliggör integrerad och oöverträffad data collection makt, kraftigt har revolutionerat vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom vissa sjukdomstillstånd samt som återspeglar den fysiologiska tillstånd av en viss cell befolkningen eller vävnad1,2,3,4. Proteomik har också visat sig vara en viktig plattform i oftalmologiska forskning på grund av känsligheten och förutsättningslös analys av olika okulära prover som underlättade identifieringen av potentiella sjukdomsmarkörer för eventuell diagnos och prognos, som framgår elegant av många studier under de senaste åren, inklusive några av våra1,5,6,7,8,9,10. Det är dock ofta svårt att få mänskliga prover för proteomiska analyser på grund av etiska skäl, särskilt med tanke på behovet av kontrollmaterial från friska individer för tillförlitlig jämförande analyser. Däremot, är det också utmanande att få tillräcklig mängd prover för optimal och pålitlig massa spektrometriska analyserna. Detta är särskilt avgörande för mass-begränsad biologiska material såsom mikro-blodkärlen i ögat. En sådan stor retrobulbär blodkärl som spelar avgörande roller i regleringen av okulära blodflödet är den korta bakre ciliära artären (sPCA). Någon störning eller anomalier i denna vaskulära sängen kan leda till allvarliga kliniska konsekvenser, vilket kan leda till patogenesen av flera synhotande sjukdomar som glaukom och nonarteritic främre ischemisk optikusneuropati (NAION)11 , 12. det finns dock en brist på studier belysa förändringarna i proteomet i denna arteriell sängen på grund av ovan nämnda nackdelarna. Därför under senare år har parlamentet svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har vuxit fram som en bra djurmodell i oftalmologiska forskning på grund av de höga morphologic och fylogenetiska likheterna mellan människor och grisar13, 14,15. Svin okulär prover är lätt tillgängliga och viktigast av allt, är mer exakt representation av mänskliga vävnader.
Med tanke på den viktiga rollen som dessa blodkärl i ögat, liksom bristen på metodik tillgodosedda effektiv protein utvinning och analyser från dessa microvesselsna, har vi tidigare präglat proteomet av de svin sPCA använder en egen protokoll som resulterade i identifieringen av ett stort antal proteiner16. Baserat på denna studie, vi har ytterligare optimerad och beskrivs ingående vår metod i denna artikel, som tillåter proteomet analys från minuten mängder prover med de svin sPCA som modell vävnad. Även om det främsta syftet med denna studie var att fastställa en MS-kompatibel metod för mass-begränsad okulära blodkärl, har vi tillhandahållit omfattande experimentella bevis att beskrivs arbetsflödet också kan tillämpas i huvudsak på olika tissue-baserade prover.
Det är tänkt att arbetsflödet kommer att vara avgörande för beredning av hög kvalitet MS-kompatibel prover från små kvantiteter av material för omfattande proteomet analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattande proteomet profilering av ett varierat utbud av okulär prover är ett viktigt och nödvändigt första steg för att klarlägga de molekylära mekanismer och signalvägar involverade i hälsa och sjukdom. För att få data av hög kvalitet och säkerställa reproducerbarheten för resultaten från dessa analyser, de föregående provberedningssteg är avgörande, som framhållits i en recension av Mandal et al. som diskuterade ingående prov bearbetning förfaranden anställa tvådimensionell gel elektrofores …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam stöds av den interna universitet forskningsmedel (Stufe 1) från universitet medicinska centrum av Mainz Johannes Gutenberg universitet och ett bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
Riferimenti
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
