इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक अति संवेदनशील और उच्च प्रवाह न्युट्रोफिल extracellular जाल (नेट) के लिए परख अर्द्ध स्वचालित ठहराव के इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीन आयामी फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo नेट गठन । इस प्रोटोकॉल के लिए अलग उत्तेजनाओं के बाद शुद्ध गठन और गिरावट का मूल्यांकन किया जा सकता है और संभावित शुद्ध लक्षित चिकित्सा अध्ययन किया जा सकता है ।
न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) immunogenic extracellular डीएनए संरचनाओं कि ट्रिगर की एक विस्तृत विविधता पर न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किया जा सकता है । जाल एक महत्वपूर्ण मेजबान रक्षा तंत्र के रूप में सेवा करने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि ट्रैप और सूक्ष्मजीवों को मारता है । दूसरी ओर, वे विविध प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों में फंसाया गया है । जाल immunogenic और विषाक्त संरचनाओं कि विरोधी न्युट्रोफिल cytoplasmic एंटीबॉडी (ऐंका)-एसोसिएटेड वाहिकाशोथ (AAV) और प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE) सहित प्रासंगिक प्रतिजनों के एक पूल होते हैं । जाल के विभिंन रूपों उत्तेजना के आधार पर प्रेरित किया जा सकता है । जाल की राशि supernatants में डीएनए रिलीज को मापने सहित विभिंन तकनीकों का उपयोग कर quantified जा सकता है, डीएनए को मापने-myeloperoxidase (MPO) या न्युट्रोफिल elastase (NE) की तरह शुद्ध अणुओं के साथ जटिल, फॉस्फोलिपिड lgg की उपस्थिति मापने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा histones, या शुद्ध-घटक है जो सभी अपनी विशिष्टता, संवेदनशीलता, निष्पक्षता, और मात्रा के बारे में अलग विशेषताएं है के cytometric का पता लगाने के प्रवाह । यहां तीन आयामी इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक उच्च संवेदनशील, उच्च प्रवाह तरीके में पूर्व vivo नेट गठन यों तो एक प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल के लिए शुद्ध गठन और स्वास्थ्य और रोग में गिरावट के बारे में विभिंन अनुसंधान प्रश्नों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है ।
न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) के गठन की प्रक्रिया है जिसमें न्यूट्रोफिल एक extracellular तीन आयामी (3 डी) वेब संरचना की तरह, रोगाणुरोधी और खतरनाक अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ जटिल में उनके डीएनए जारी है, दानेदार और cytoplasmic एंजाइमों, पेप्टाइड्स और प्रोटीन । इन immunogenic और विषाक्त संरचनाओं को फँसाने और संक्रामक रोगजनकों की हत्या द्वारा स्वस्थ व्यक्तियों की सहज प्रतिरक्षा रक्षा में एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका है1. हालांकि, वे भी घनास्त्रता2 और विभिंन प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों में शामिल होने का प्रदर्शन किया गया है, सहित विरोधी न्युट्रोफिल cytoplasmic एंटीबॉडी (ऐंका)-एसोसिएटेड वाहिकाशोथ (AAV)3, प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE )4,5, antiphospholipid सिंड्रोम (ए पी एस)2,6, रुमेटी गठिया (आरए), सोरायसिस, और गाउट7,8,9।
इन विट्रो नेट गठन व्यापक रूप से रासायनिक यौगिक phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) है, जो बड़े पैमाने पर शुद्ध गठन लाती है के साथ अध्ययन किया गया है । हालांकि सबसे शारीरिक उत्तेजनाओं शुद्ध गठन10के बहुत निचले स्तर को प्रेरित । अध्ययन करने के लिए शुद्ध-में चलाता है, उदाहरण के लिए, एक स्व-प्रतिरक्षित रोग सेटिंग, एक मानकीकृत, संवेदनशील, उच्च प्रवाह मात्रात्मक परख का पता लगाने और शुद्ध गठन यों तो की जरूरत है । जाल के ठहराव के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है और वर्तमान में विभिंन तरीकों से किया जाता है, अपने स्वयं के फायदे और सीमाओं11के साथ प्रत्येक । एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विधि supernatants12में डीएनए का पता लगाने है, जो उद्देश्य है, लेकिन डीएनए के मूल के बीच भेदभाव नहीं करता है (अपोप्तोटिक, गल, जाल), और इसलिए जाल के लिए बहुत विशिष्ट नहीं है. दूसरे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) डीएनए-नेट के साथ परिसर में विशिष्ट प्रोटीन, उदाहरण के लिए, myeloperoxidase (MPO) या न्युट्रोफिल elastase (NE), एक और अधिक विशिष्ट दृष्टिकोण के लिए जाल का पता लगाने और कर रहे थे को अच्छी तरह से सहसंबंधी बनाना प्रदर्शन फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन-३ (CitH3) सकारात्मक आकाराची१३. हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि इस विधि के लिए पर्याप्त सभी जाल लेने के लिए संवेदनशील है (जैसे, MPO, NE, और CitH3 नकारात्मक जाल) । एक तीसरा दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी है कि नेट से जुड़े अणुओं के सह स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है (NE, MPO, CitH3) जाल यों तो extracellular डीएनए के साथ. यह विधि आम तौर पर जाल के लिए विशिष्ट है, लेकिन यह एक उच्च प्रवाह पद्धति के रूप में लागू नहीं किया जा सकता और पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह के कारण उद्देश्य नहीं है । इसके अतिरिक्त, इस विधि खाते में नहीं ले MPO-, NE-, CitH3-नकारात्मक जाल है कि अक्सर इस्तेमाल किया नेट-ट्रिगर14,15के आधार पर मौजूद हैं । शुद्ध-टिंग न्यूट्रोफिल16में नाभिक की सूजन का संकेत एक परिवर्तित आगे/sideward तितर बितर (FSC/एसएससी) के माध्यम से जाल का पता लगाने के cytometry दृष्टिकोण प्रवाह । इस विधि खाते में शुद्ध गठन की है कि पहचान की गई है, जो इस तरह के महत्वपूर्ण शुद्ध गठन17के रूप में नाभिक की सूजन शामिल नहीं हो सकता है के विभिंन रूपों में नहीं ले करता है । अन्त में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी कल्पना करने के लिए लागू किया गया है और सीधे एक सेल के साथ extracellular डीएनए धुंधला द्वारा शुद्ध गठन मात्रा-अभेद्य डाई कि दाग extracellular डीएनए12,18. आम तौर पर, 5 से 10 उच्च शक्ति क्षेत्र मैंयुअल रूप से उठाया और मूल्यांकन कर रहे हैं, जो एक अच्छी तरह से ९६ प्लेट11,17के प्रत्येक कुआं के 1-5% शामिल हैं । छवियों के मैनुअल चयन हमेशा उद्देश्य नहीं है, पूर्वाग्रह से ग्रस्त है और उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए आकर्षक नहीं है । एक स्वचालित, उच्च प्रवाह शुद्ध ठहराव परख हाल ही में विकसित किया गया था, जो अच्छी तरह से एक 3 डी जेड के माध्यम से 13 µm को कवर तरीके से 11% image-stacked इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी, जिससे एक अति संवेदनशील तकनीक के लिए नेतृत्व करने के लिए जाल का आकलन पारंपरिक तरीकों की तुलना में10. वर्तमान रिपोर्ट का वर्णन सबसे हाल ही में प्रोटोकॉल के माध्यम से एक स्वचालित, अति संवेदनशील 3d फोकल माइक्रोस्कोपी, जो एक अच्छी तरह से ४५% की कुल imaged क्षेत्र प्राप्त है और जेड के माध्यम से 27 µm कवर का उपयोग परख के माध्यम से शुद्ध गठन-पोट । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संवेदनशीलता, एक उद्देश्य और निष्पक्ष तरीके से शुद्ध गठन के निम्न स्तर के साथ, यों तो उपयुक्त है ।
इस परख का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि न्यूट्रोफिल कम रहते है और मर जब जमे हुए है प्रत्येक प्रयोग के लिए हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की जरूरत है । यह एक स्वस्थ दाता हर बार है, जो कुछ दाता विशेषताओं के कारण रूपांतरों फंसाने सकता है की आवश्यकता है । इन परिवर्तनों में से एक न्यूट्रोफिल की सक्रियण स्थिति है । न्यूट्रोफिल पहले से ही vivo में अलगाव से पहले सक्रिय हो सकता है । इसके अलावा, न्यूट्रोफिल एरिथ्रोसाइट्स के lysis के दौरान विशेष रूप से अलगाव कदम भर में सक्रिय किया जा सकता है, इसलिए न्यूट्रोफिल के एक अनुभवी हेंडलर न्यूट्रोफिल के सक्रियण को कम करने के लिए आवश्यक है । सामांय में, न्यूट्रोफिल के अलगाव के रूप में जल्दी के रूप में संभव के रूप में रक्त ड्राइंग और प्रयोग अत्यधिक सहज सक्रियण से बचने के लिए नहीं रोका जाना चाहिए किया जाना चाहिए । दूसरे, न्यूट्रोफिल के किसी न किसी हैंडलिंग से बचना चाहिए । जैसे, वर्णित प्रोटोकॉल का उल्लेखनीय लाभ ंयूनतम pipetting हस्तक्षेप एक बार न्यूट्रोफिल एक ९६-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण स्थिति सबसे उत्तेजित हालत, जिसमें इस परख संवेदनशील शुद्ध गठन के निंन स्तर का पता लगाने में कर सकते है का मूल्यांकन किया है । एक और पहलू है कि परख प्रभावित कर सकता है माध्यम में FCS का उपयोग है । FCS का प्रतिशत 10% से 2% से कम किया गया है एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि19,20 या गर्मी निष्क्रियता के बावजूद न्यूट्रोफिल के संभावित सक्रियण द्वारा शुद्ध गठन के संभावित दमन से बचने के लिए । FCS के बिना संस्कृति या उपयोग के साथ मीडिया के विभिंन प्रकारों की कोशिश नहीं की गई है । एक उत्तेजित या मध्यम नियंत्रण हमेशा साथ लिया जाता है जब परख प्रदर्शन के लिए पृष्ठभूमि संकेत का एक संकेत है (जैसे, न्यूट्रोफिल के सक्रियकरण की स्थिति) । उत्तेजित नमूना की तुलना में प्रत्येक उत्तेजना के लिए गुना वृद्धि एक ही उत्तेजना का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगों पर लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रदर्शित किया जाता है.
एक संभव उच्च पृष्ठभूमि के लिए एक महत्वपूर्ण कारक extracellular डीएनए है कि शुद्ध गठन की प्रक्रिया के लिए असंबंधित है के दाग है । वर्तमान परख 15 मिनट की छोटी गर्मी की अवधि के तुरंत बाद extracellular डीएनए धुंधला हटाने और निर्धारण के बाद सीधे प्लेट का विश्लेषण करके इस को कम करने का प्रयास करता है । इसलिए, यह एक उंनत फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि पर्याप्त गति और विश्लेषणात्मक शक्ति के लिए 1 के भीतर ९६-अच्छी तरह से थाली पर कब्जा करने के लिए 2 ज. जोखिम समय और ध्यान के स्वचालित सेटिंग की सिफारिश की है । जैसे, माइक्रोस्कोप सेटिंग प्रत्येक नमूने और रंग तीव्रता दहलीज जो समग्र इष्टतम चित्र गुणवत्ता के लिए आवश्यक है के संबंध में प्रयोग के बीच भिन्न हो सकते हैं । उत्तरार्द्ध सही ढंग से न्यूट्रोफिल और जाल और इष्टतम सेटिंग इसलिए कई नियंत्रण नमूनों का उपयोग करके पुष्टि की जानी चाहिए करने के लिए अंतिम क्षमता को प्रभावित करता है (जैसे, स्वस्थ नियंत्रण के सीरम). कैप्चर की गई छवियों के विश्लेषण के दौरान, विश्लेषण प्रोग्राम में पिक्सेल थ्रेशोल्ड और आकार थ्रेशोल्ड का उपयोग शुद्ध गठन के बेहतर चयन के लिए अनुमति देता है.
Extracellular डीएनए शुद्ध गठन से व्युत्पंन NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis या भी गैर महत्वपूर्ण शुद्ध गठन1के lytic प्रक्रिया सहित अलग मौत मार्ग, का परिणाम हो सकता है । जैसे, वर्तमान परख की एक सीमा है कि केवल extracellular डीएनए के लिए धुंधला द्वारा कोई शुद्ध गठन और अंय प्रासंगिक सेल मौत रास्ते के बीच भेदभाव संभव है । यह विभिंन रूपों के बीच भेदभाव करने के लिए अलग मौत रास्ते के चुनिंदा अवरोधकों का उपयोग करके इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए संभव है underpinning शुद्ध गठन या citH3 और NE जैसे विशिष्ट नेट मार्करों की उपस्थिति अलग immunostainings द्वारा की पुष्टि, डीएनए के साथ सह-स्थानीयकृत । सह citH3 और NE के साथ extracellular डीएनए के स्थानीयकरण हाल ही में इस परख10के लिए पुष्टि की गई है । इस परख में शुद्ध विशिष्ट मार्कर से बचने का लाभ, शुद्ध गठन के सभी रूपों का आकलन करने के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा डीएनए के बाहर निकालना के लिए अग्रणी के रूप में पूरा और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग की क्षमता के साथ संभव के रूप में उद्देश्य की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता कम स्तर पर शुद्ध प्रेरण ऑटो में प्रतिरक्षा परिसरों-प्रतिरक्षा रोग है जिसमें गुणात्मक और मात्रात्मक मतभेदों का पता लगाने की क्षमता प्रक्रिया के प्रकार से अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है द्वारा मध्यस्थता की पढ़ाई में दिखाया गया है 10,21,22शामिल हैं । illustrating है कि इस उपंयास नेट ठहराव परख अलग शोधकर्ताओं के लिए जोड़ा मूल्य का हो सकता है शुद्ध गठन के विभिंन पहलुओं की जांच । परख करने के लिए छोटे समायोजन आसानी से लागू कर रहे हैं: उत्तेजना अवधि के समायोजन, एक पसंदीदा नेट मार्कर के उपयोग के लिए एक विशिष्ट मौत मार्ग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए शुद्ध गठन के लिए अग्रणी, एक अलग इज़ाफ़ा या विभिंन शुद्ध मानदंडों के उपयोग के उपयोग में ठहराव और विश्लेषण ।
अंत में, प्रदान की प्रोटोकॉल एक उच्च संवेदनशील अर्ध के लिए मोटे तौर पर लागू परख है, विभिंन उत्तेजनाओं पर नेट के पूर्व विवो प्रेरण के मूल्यांकन के लिए शुद्ध गठन के स्वचालित ठहराव ।
The authors have nothing to disclose.
Eline जे Arends और Y.K. Onno तेंग का काम डच गुर्दा फाउंडेशन (17OKG04), नीदरलैंड संगठन से नैदानिक फैलोशिप वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (९०७१३४६०) द्वारा समर्थित है । लौरा एस वान बांध का काम संधिवातीयशास्त्र में अनुसंधान के लिए फाउंडेशन (FOREUM) द्वारा समर्थित है ।
Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |