Denne protokollen beskriver en svært følsom og høy gjennomstrømning nøytrofile ekstracellulære felle (NET) analysen for den semi-automatisert kvantifiseringen av ex vivo NET dannelsen av immunofluorescence tredimensjonal AC confocal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes til å evaluere netto dannelse og fornedrelse etter ulike stimuli og kan brukes til å studere mulige NET-målrettet terapi.
Nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er immunogenic ekstracellulære DNA-strukturer som kan bli utgitt av nøytrofile på en rekke utløsere. Garn har vist seg for å fungere som en viktig vert forsvar mekanisme som feller og dreper mikroorganismer. På den annen side, har de vært innblandet i ulike systemisk autoimmune sykdommer. Nettene er immunogenic og giftig strukturer som inneholder et utvalg av relevante autoantigens inkludert anti-neutrophil cytoplasmatiske antistoffer (ANCA)-tilknyttede vaskulitt (AAV) og systemisk lupus erythematosus (SLE). Ulike former for garn kan bli indusert avhengig av stimulans. Mengden av nett kan kvantifiseres bruke ulike teknikker som måler DNA utgivelse i supernatants, måle DNA-kompleksbundet med NET-molekyler som myeloperoxidase (MPO) eller nøytrofile elastase (NE), måle tilstedeværelsen av citrullinated histones av fluorescens mikroskopi eller flyt cytometric påvisning av NET-komponenter som har forskjellige funksjoner om deres spesifisitet, følsomhet, objektivitet og antall. Her er en protokoll for å kvantifisere ex vivo NET formasjon i en svært sensitive, høy gjennomstrømming måte ved å bruke tredimensjonale immunofluorescence AC confocal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes for å løse ulike problemstillinger om NET dannelse og fornedrelse i helse og sykdom.
Dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er prosessen der nøytrofile løslate deres DNA i en ekstracellulære tredimensjonale (3D) web som struktur, kompleksbundet med et bredt spekter antimikrobielle og farlig molekyler, granulerte og cytoplasmatiske enzymer, peptider og proteiner. Disse immunogenic og giftige strukturer har en viktig fysiologiske rolle i medfødte immunsystemet forsvaret av friske individer ved overlapping og drepe smittsomme patogener1. Men de har også blitt vist for å være involvert i trombose2 og ulike systemisk autoimmune sykdommer, inkludert anti-neutrophil cytoplasmatiske antistoffer (ANCA)-forbundet vaskulitt (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antiphospholipid syndrom (APS)2,6, revmatoid artritt (RA), psoriasis og gikt7,8,9.
In vitro netto dannelsen har vært mye studert med det kjemiske sammensatte phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), som induserer massive netto formasjon. Men mest fysiologiske stimuli indusere mye lavere nivåer av netto formasjon10. Å studere NET-utløsere i, for eksempel en autoimmun sykdom setting, er en standardisert, følsom, høy gjennomstrømming kvantitative analysen nødvendig for å oppdage og kvantifisere netto formasjon. Kvantifisering av garn har vist seg for å være utfordrende og utføres nå av forskjellige metoder, hver med sine egne fordeler og begrensninger11. En vanlig metode er oppdagelsen av DNA i den supernatants12, som er målet, men ikke diskriminerer mellom opprinnelsen til DNA (apoptotisk, nekrose, garn), og derfor er ikke meget spesifikk for garn. For det andre enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) av DNA-kompleksbundet med NET-spesifikke proteiner, for eksempel myeloperoxidase (MPO) eller nøytrofile elastase (NE), er en mer konkret tilnærming til oppdage garn og ble vist for å korrelere med citrullinated histone-3 (CitH3) positive garn13. Men er det ikke kjent om denne metoden er sensitive nok til å plukke opp alle garn (f.eks MPO, NE, og CitH3 negative nett). En tredje tilnærming er immunofluorescence mikroskopi som brukes til å oppdage co lokalisering av NET-assosiert molekyler (NE, MPO, CitH3) med ekstracellulære DNA å kvantifisere garn. Denne metoden er vanligvis spesifikke for garn, men det kan ikke brukes som høy gjennomstrømming og ikke mål på grunn av observatør bias. I tillegg tar denne metoden ikke hensyn MPO-, NE-, CitH3-negativ garn som er ofte avhengig av brukt NET-utløser14,15. Flow cytometri tilnærminger oppdage garn gjennom et endret forover/sidelengs scatter (FSC/SSC) indikerer hevelse av kjernen i NET-ting nøytrofile16. Denne metoden tar ikke hensyn til ulike former for netto formasjon som har blitt identifisert, som ikke kanskje involverer hevelse i kjernen, som avgjørende netto formasjon17. Til slutt, immunofluorescence AC confocal mikroskopi er brukt for å visualisere og kvantifisere netto dannelsen av direkte flekker ekstracellulære DNA med en celle-ugjennomtrengelig fargestoff som flekker ekstracellulære DNA12,18. Vanligvis er 5 til 10 høyeffekts felt manuelt plukket og vurdert, som dekker 1-5% av hver brønn en 96-brønns plate11,17. Manuelt valg av bilder er ikke alltid objektiv, utsatt for partiskhet og ikke attraktiv for høy gjennomstrømming analyse. En automatisert, høy gjennomstrømming netto kvantifisering analysen ble nylig utviklet, som avbildet 11% av brønnen i en 3D måte dekker 13 µm gjennom Z-stablet immunofluorescence AC confocal mikroskopi, og dermed fører til en svært følsom teknikk å vurdere garn i forhold til konvensjonelle metoder10. Gjeldende rapport beskriver den nyeste protokollen for å kvantifisere netto formasjon gjennom en automatisert, svært følsom analysen med 3D AC confocal mikroskopi, som oppnår et bildebasert totalareal på 45% av hver brønn og dekker 27 µm gjennom Z-stabler. Denne protokollen er egnet til å kvantifisere, med en høy følsomhet, lave nivåer av netto formasjon i en objektiv og upartisk måte.
Den viktigste delen av denne analysen er behovet for å bruke fersk isolert nøytrofile for hvert eksperiment fordi nøytrofile er kortvarige og dø når frosset. Dette krever en frisk donor hver gang, som kunne implisere noen variasjoner på grunn av donor egenskapene. En av disse variantene er aktiviseringen rang av nøytrofile. Nøytrofile kan aktiveres allerede i vivo før isolasjon. I tillegg nøytrofile kan aktiveres gjennom punktene isolasjon spesielt under lysis av erytrocytter, derfor en erfaren handler nøytrofile er nødvendig for å minimere aktivering av nøytrofile. Generelt, isolering av nøytrofile skal utføres så snart som mulig etter blod tegne og eksperimentet bør ikke stoppes midlertidig for å unngå overdreven spontan aktivering. Dernest bør uforsiktig håndtering av nøytrofile unngås. Som sådan, er den bemerkelsesverdige fordelen med beskrevet protokollen minimal pipettering intervensjonene når nøytrofile er sådd i en 96-brønns plate. Viktigere, er aktiviseringen rang av nøytrofile best ilignet i unstimulated tilstand, som denne analysen finner følsomt lave nivåer av netto formasjon. En annen faktor som kan påvirke analysen er bruk av FCS i mediet. Andelen FCS er blitt avtatt fra 10% til 2% å unngå mulig undertrykkelse av netto dannelsen av antioksidant aktivitet19,20 eller mulig aktivering av nøytrofile tross varme inaktivering. Kultur uten FCS eller bruke ulike typer medier har ikke vært forsøkt. En unstimulated eller middels kontroll er alltid tatt langs når analysen har en indikasjon på bakgrunn signal (f.eks, aktivisering rang av nøytrofile). Fold øker for hver stimulans sammenlignet unstimulated prøven vises for å oppnå konsistente resultater over forskjellige eksperimenter ved hjelp av samme stimulans.
En viktig faktor for en mulig høy bakgrunn er flekker ekstracellulære DNA som er relatert til prosessen med netto formasjon. Nåværende analysen forsøker å redusere dette ved å fjerne den ekstracellulære DNA flekker umiddelbart etter kort vekst på 15 min og analysere platen direkte etter fiksering. Derfor er det viktig å bruke en avansert AC confocal mikroskop som har nok fart og analytisk kraften 96-brønns platen innen 1 til 2 h. automatisert eksponeringstid og fokus er anbefalt. Slik kan innstillingen mikroskop variere mellom hver prøve og eksperimentere med hensyn til farge intensitet terskelen som er nødvendig for samlet optimal bildekvalitet. Sistnevnte påvirkninger eventuell evnen å riktig kvantifisere nøytrofile og garn og den optimale innstillingen bør derfor bli bekreftet av flere kontroll utvalg (f.eks serum sunn kontroller). Under analysen av bildene gir bruk av en piksel terskelen og size terskel i analyseprogrammet et bedre utvalg av netto formasjon.
Ekstracellulære DNA fra NET formasjon kan være et resultat av forskjellige død, inkludert NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller selv ikke-lytisk prosessen med viktig netto formasjon1. Slik er en begrensning av nåværende analysen at av flekker bare for ekstracellulære DNA det er ingen forskjell mulig mellom netto formasjon og andre relevante celle død trasé. Det er mulig å oppnå dette ved å bruke enten selektiv hemmere av forskjellige død å skille mellom ulike former underbygger netto formasjon eller bekrefte av separat immunostainings tilstedeværelse av bestemte netto markører, som citH3 og NE, Co lokalisert med DNA. Den co lokaliseringen av ekstracellulære DNA med citH3 og NE har nylig blitt bekreftet for denne analysen10. Fordelen med å unngå NET bestemt markører i denne analysen, kan vurdere alle former for netto formasjon fører til ekstrudering DNA av nøytrofile så fullstendig og så objektiv som mulig med potensial for høy gjennomstrømming screening. Anvendelsen av denne protokollen har vært vist i studier lavt nivå netto induksjon formidlet av immun komplekser i auto-immune sykdommer som muligheten til å oppdage kvalitativ og kvantitativ forskjeller kan være viktigere enn Prosesstypen involvert10,21,22. Illustrerer at denne romanen netto kvantifisering analysen kan være av verdi for ulike forskere å undersøke ulike sider av netto formasjon. Små justeringer analysen implementeres enkelt: justering av stimulering perioden, bruk av en favoritt netto markør å fokusere på en bestemt død sti fører til netto formasjon, bruk av en annen forstørrelse eller bruk av ulike netto kriterier i kvantifisering og analyse.
Avslutningsvis er protokollen gitt en svært sensitive bredt aktuelt analysen for den semi-automatisert kvantifiseringen av netto formasjon for vurdering av ex vivo induksjon av garn på ulike stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Eline J. Arends og Y.K. Onno Teng støttes av nederlandske nyre Foundation (17OKG04), klinisk fellesskap fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (90713460). Laura S. van DAMS arbeid støttes av grunnlaget for forskning i Rheumatology (FOREUM).
Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |