Det här protokollet beskriver en mycket känslig och hög genomströmning neutrofila extracellulära fällan (NET) analys för halvautomatisk kvantifiering av ex vivo NET bildandet av immunofluorescens tredimensionella konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan användas för att utvärdera NET bildning och nedbrytning efter olika stimuli och kan användas för att studera potentiella NET-riktade terapier.
Neutrofila extracellulära fällor (nät) är immunogent extracellulära DNA-strukturer som kan frigöras av neutrofiler vid en mängd olika utlösare. NETs har visat sig fungera som ett viktigt värd försvarsmekanism som fällor och dödar mikroorganismer. Däremot, har de varit inblandade i olika systemiska autoimmuna sjukdomar. Nät är immunogena och giftiga strukturer som innehåller en pool av relevanta autoantigener inklusive anti neutrofiler cytoplasmatiska antikroppar (ANCA)-associerad vaskulit (AAV) och systemisk lupus erythematosus (SLE). Olika former av nät kan induceras beroende på stimulans. Mängden nät kan kvantifieras med hjälp av olika tekniker inklusive mäta DNA release i supernatanterna, mäta DNA-komplex med NET-molekyler som myeloperoxidas (MPO) eller neutrofila elastase (NE), mäta förekomsten av citrullinerade histoner genom fluorescensmikroskopi, eller flöde flödescytometrisk detektion av NET-komponenter som alla har olika funktioner avseende deras specificitet, känslighet, objektivitet och kvantitet. Här är ett protokoll för att kvantifiera ex vivo NET bildning i en mycket känslig, hög genomströmning sätt med hjälp av tredimensionella immunofluorescens konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan tillämpas för att hantera olika forskningsfrågor om netto bildning och nedbrytning i hälsa och sjukdom.
Bildningen av neutrofila extracellulära fällor (nät) är den process där neutrofiler släppa deras DNA i en extracellulär tredimensionella (3D) web liknande struktur, komplex med ett brett utbud av antimikrobiella och farliga molekyler, granulat och cytoplasmiska enzymer, peptider och proteiner. Dessa immunogent och giftiga strukturer har en viktig fysiologisk roll i det medfödda immunförsvaret hos friska individer genom svällning och dödande smittsamma patogener1. Dock har de också visat sig vara inblandade i trombos2 och olika systemiska autoimmuna sjukdomar, inklusive anti neutrofiler cytoplasmatiska antikroppar (ANCA)-associerade vaskulit (AAV)3, systemisk lupus erythematosus (SLE )4,5, antifosfolipidsyndrom (APS)2,6, reumatoid artrit (RA), psoriasis och gikt7,8,9.
In vitro-NET bildandet har studerats allmänt med den kemiska sammansatt phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA), som inducerar massiv NET bildandet. Men mest fysiologiska stimuli framkalla mycket lägre nivåer av NET bildandet10. Till studien NET-utlösare i, till exempel en autoimmun sjukdom behövs en standardiserad, känslig, hög genomströmning kvantitativ analys att påvisa och kvantifiera NET bildandet. Kvantifiering av nät har visat sig vara utmanande och utförs för närvarande av olika metoder, var och en med sina egna fördelar och begränsningar11. En vanligt förekommande metod är upptäckt av DNA i supernatanterna12, vilket är målet men inte diskriminerar mellan beskärningen av DNA (apoptotiska, nekrotiska, nät), och därför inte är mycket specifika för nät. För det andra, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) av DNA-komplex med NET-specifika proteiner, till exempel myeloperoxidas (MPO) eller neutrofila elastase (NE), är en mer specifik inställning till upptäcka nät och påvisades för att korrelera väl med citrullinerade Histon-3 (CitH3) positiva nät13. Det är dock inte känt om denna metod är tillräckligt känslig för att plocka upp alla nät (t.ex. MPO, NE, och CitH3 negativa nät). En tredje metod är immunofluorescens mikroskopi som används för att identifiera samtidig lokalisering av NET-associerade molekyler (NE, MPO, CitH3) med extracellulära DNA att kvantifiera nät. Denna metod är vanligen specifika för nät, men det kan inte tillämpas som en hög genomströmning metod och är inte mål på grund av observatör bias. Dessutom, tar den här metoden inte hänsyn MPO-, NE-, CitH3-negativa nät som är vanligt förekommande beroende på den använda NET-trigger14,15. Flöde flödescytometri metoder upptäcka nät genom en förändrad framåt/sidled scatter (FSC/SSC) som anger svullnad av kärnan i NET-ting neutrofiler16. Den här metoden tar inte hänsyn till olika former av NET formation som har identifierats, som inte skulle kunna medföra svullnad av kärnan, såsom avgörande NET bildandet17. Slutligen, immunofluorescens konfokalmikroskopi har tillämpats för att visualisera och kvantifiera NET bildandet av direkt färgning extracellulära DNA med ett cell-impermeable färgämne som fläckar extracellulära DNA12,18. Allmänhet, 5 till 10 high-power fält manuellt plockas och bedömas, som omfattar 1-5% av varje brunn en plattan med 96 brunnar11,17. Manuellt val av bilder är inte alltid objektiva, benägna att bias och inte attraktiv för hög genomströmning analys. En automatiserad, hög genomströmning NET kvantifiering analys utvecklades nyligen, som avbildas 11% av brunnen på en 3D sätt täcker 13 µm genom Z-staplade immunofluorescens konfokalmikroskopi, vilket ledde till en mycket känslig teknik att bedöma nät jämfört med de konventionella metoder10. Den aktuella rapporten beskriver den senaste protokollet för att kvantifiera NET bildning genom en automatiserad, mycket känslig analys använder 3D konfokalmikroskopi, som uppnår en avbildad yta av 45% av varje brunn och omfattar 27 µm igenom Z-högar. Detta protokoll är lämplig att kvantifiera, med en hög känslighet, låga nivåer av NET bildande på ett objektivt och opartiskt sätt.
Den mest kritiska delen av denna analys är behovet av att använda färska isolerade neutrofiler för varje experiment eftersom neutrofiler är kortlivade och dör när frusen. Detta kräver en frisk givare varje gång, vilket kunde implicerade några variationer på grund av givare egenskaper. En av dessa variationer är aktiveringen ställningen av neutrofilerna. Neutrofiler kan aktiveras redan invivo före isolering. Dessutom neutrofiler kan aktiveras i hela isolering stegen särskilt under lys av erytrocyter, därför en erfaren hanterare av neutrofiler krävs att minimera aktivering av neutrofiler. I allmänhet, isolering av neutrofiler bör utföras så snart som möjligt efter blod och experimentet bör inte pausas för att undvika överdriven spontana aktivering. För det andra, ovarsam hantering av neutrofiler bör undvikas. Som sådan, är anmärkningsvärda fördelen med protokollet beskrivs minimal pipettering ingripanden när neutrofiler är seedade i en plattan med 96 brunnar. Ännu viktigare, bedöms aktiveringen ställningen av neutrofilerna bäst i ostimulerade tillstånd, i vilket denna analys känsligt kan upptäcka låga nivåer av NET bildandet. En annan faktor som kan påverka analysen är användningen av FCS i mediet. Procentandelen av FCS har sänkts från 10% till 2% för att undvika möjliga dämpning av NET bildandet av antioxidant aktivitet19,20 eller möjligt aktiveringen av neutrofilerna trots Värmeinaktivering. Kultur utan FCS eller med att använda olika typer av media har inte prövats. En ostimulerade eller medium kontroll tas alltid längs när du utför analysen att ha en indikation på den bakgrund signalen (t.ex., aktiveringen ställningen av neutrofilerna). Den faldig ökningen för varje stimulus jämfört ostimulerade provet visas för att uppnå konsekventa resultat över olika experiment med samma stimulans.
En viktig faktor för en möjlig hög bakgrund färgning av extracellulära DNA som är orelaterade till processen för NET bildandet. Närvarande analysen försöker minska detta genom att ta bort den extracellulära DNA färgning direkt efter den korta inkubationstiden för 15 min och genom att analysera plattan direkt efter fixering. Därför är det viktigt att använda en avancerad confocal Mikroskop som har tillräckligt fart och analytisk kraft att fånga plattan med 96 brunnar inom 1 till 2 h. automatisk inställning av exponeringstid och fokusera rekommenderas. Som sådan, kan inställningen Mikroskop varierar mellan varje prov och experimentera med avseende på tröskeln färg intensitet som är nödvändig för övergripande optimal bildkvalitet. De sistnämnda påverkan eventuella förmåga att korrekt kvantifiera neutrofiler och nät och optimal inställning bör därför bekräftas med hjälp av flera kontrollprover (t.ex. serum hos friska kontroller). Under analysen av tagna bilder tillåter användning av en pixel tröskel och storlekströskelvärdet i programmet analys för ett bättre urval av NET bildandet.
Extracellulära DNA härrör från netto formation kan vara resultatet av distinkta död upptagsvägar, inklusive NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis eller ens icke-lytisk process av vitala NET bildandet1. Som sådan, är en begränsning av nuvarande analysen att genom färgning endast för extracellulära DNA finns ingen differentiering mellan netto bildandet och andra relevanta cell death vägar. Det är möjligt att uppnå detta genom att använda antingen selektiva hämmare av distinkta död vägar att diskriminera mellan olika former som underbygger NET bildandet eller bekräfta genom separata immunostainings förekomsten av specifika NET markörer, såsom citH3 och NE, Co lokaliserade med DNA. Samtidig localizationen av extracellulära DNA med citH3 och NE har nyligen bekräftats för denna analys10. Fördelen med att undvika NET specifika markörer i denna analys, tillåter för att bedöma alla former av NET bildandet leder till extrudering av DNA av neutrofiler komplett och så objektiv som möjligt med potential för hög genomströmning screening. Tillämpligheten av detta protokoll har visats i studier låg nivå NET induktion medieras av immunkomplex i autoimmun sjukdom där förmågan att upptäcka kvalitativa och kvantitativa skillnader kan vara viktigare än typen av process inblandade10,21,22. Illustrerar att denna roman NET kvantifiering analys kan vara till mervärde för olika forskare att undersöka olika aspekter av NET bildandet. Små justeringar till analysen genomförs enkelt: justering av perioden stimulering, användning av en favorit NET markör att fokusera på en specifik död väg leder till netto bildandet, användning av olika förstoring eller användning av olika NET kriterier i den kvantifiering och analys.
Sammanfattningsvis är protokollet föreskrivs en mycket känsliga allmänt tillämpliga analys för halvautomatisk kvantifiering av NET bildandet för utvärdering av ex vivo induktion av nät på olika stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Eline J. Arends och Y.K. Onno Teng arbete stöds av nederländsk njure Foundation (17OKG04), kliniska stipendium från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (90713460). Laura S. van Dams arbete stöds av Stiftelsen för forskning i reumatologi (FOREUM).
Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |