JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biochimica

Forberedelse af svampe og plantematerialer for strukturelle udredning ved hjælp af dynamisk nuklear polarisering Solid-State NMR

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

En protokol for at forberede 13C,15N-mærket svampe og vegetabilske prøver til multidimensional solid-state NMR spektroskopi og dynamisk nuklear polarisering (DNP) undersøgelser er præsenteret.

Abstract

Denne protokol viser hvordan ensartet 13C, 15N-mærket svampe materialer kan være produceret og hvordan disse bløde materialer bør være gået for solid-state NMR og følsomhed-forstærket DNP eksperimenter. Prøven forædling af plantebiomasse er også detaljeret. Denne metode giver mulighed for måling af en serie af 1D og 2D 13C –13C /15N korrelationer spektre, som giver høj opløsning strukturelle udredning af komplekse biomaterialer i deres oprindelige tilstand, med minimal undertrykkelse af netbårne. Isotop-mærkning kan blive undersøgt af kvantificere intensitet i 1D spectra og polarisering overførsel effektivitet i 2D korrelation spektre. Succes dynamisk nuklear polarisering (DNP) til forberedelse af prøven kan vurderes af følsomhed enhancement faktor. Yderligere eksperimenter undersøger de strukturelle aspekter af polysaccharider og proteiner vil føre til en model af de tre-dimensionelle arkitektur. Disse metoder kan ændres og tilpasses for at undersøge en lang række kulhydratrige materialer, herunder de naturlige cellevægge af planter, svampe, alger og bakterier, såvel som syntetiseres eller designet kulhydratpolymerer og deres komplekse med andre molekyler.

Introduction

Kulhydrater spiller en central rolle i forskellige biologiske processer såsom energilagring, strukturelle opbygning og cellular anerkendelse og vedhæftning. De er beriget i cellevæggen, hvilket er en grundlæggende komponent i planter, svampe, alger og bakterier1,2,3. Cellens væg fungerer som en central kilde til produktion af biobrændstoffer og biomaterialer samt et lovende mål for antimikrobielle behandlingsformer4,5,6,7,8 , 9.

Den moderne forståelse af disse komplekse materialer har været betydeligt avancerede af årtiers bestræbelser, der var afsat til strukturel karakterisering ved hjælp af fire større biokemiske eller genetiske metoder. Den første store metode bygger på sekventiel behandlinger ved hjælp af barske kemikalier eller enzymer til at nedbryde cellevægge i forskellige dele, der efterfølges af kompositoriske og kobling analyse af sukker i hver fraktion10. Denne metode belyser domæne fordelingen af polymerer, men fortolkningen kan være misvisende på grund af de kemiske og fysiske egenskaber af biomolekyler. For eksempel, er det vanskeligt at afgøre, om den alkali-ekstraherbare brøkdel stammer fra et enkelt domæne af mindre struktureret molekyler eller rumligt separerede molekyler med sammenlignelige opløselighed. For det andet den udpakkede dele eller hele cellevægge kan også måles ved hjælp af løsning NMR til at bestemme de kovalente forbindelser, også betegnes som crosslinking, mellem forskellige molekyler11,12,13, 14,15. På denne måde, kovalente ankre detaljerede struktur kunne blive aftestede, men begrænsninger kan findes på grund af den lave Opløselighed af polysaccharider, det relativt lille antal crosslinking websteder og uvidenhed om non-kovalente effekter, der stabiliserer polysaccharid pakning, herunder hydrogenbindende, van der Waals kraft, elektrostatiske interaktion og polymer entanglement. For det tredje har bindende affinitet været beslutsom in vitro- ved hjælp af isolerede polysaccharider16,17,18,19, men rensning procedurer kan væsentligt ændre struktur og egenskaber af disse biomolekyler. Denne metode også undlader at replikere sofistikerede deposition og samling af makromolekyler efter biosyntesen. Endelig, fænotype, celle morfologi og mekaniske egenskaber af genetiske mutanter med svækkede produktionen af visse cellevæg komponent kaste lys på de strukturelle funktioner af polysaccharider, men mere molekylære beviser er nødvendige for at slå bro over disse makroskopiske observationer med funktionen manipuleret af protein machineries20.

Seneste fremskridt inden for udvikling og anvendelse af multidimensional solid-state NMR spektroskopi har indført en enestående lejlighed til at løse disse strukturelle opgaver. 2D/3D solid-state NMR eksperimenter aktiverer høj opløsning undersøgelse af sammensætningen og arkitektur af kulhydrat-rige materialer i den native tilstand uden større undertrykkelse af netbårne. Strukturelle undersøgelser er gennemført med succes på både primær og sekundær cellevægge af planter, katalytisk behandlede biomassen, bakterielle biofilm, pigment spøgelser i svampe og for nylig af forfattere, intakt cellevægge i en patogen svamp Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. udvikling af dynamiske nukleare polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 letter væsentligt NMR strukturelle udredning som følsomhed styrkelse af DNP markant forkorter den eksperimentelle tid på disse komplekse biomaterialer. Protokollen beskrevet her detaljer procedurerne for isotop-mærkning svamp A. fumigatus og forberede svampe og vegetabilske prøver for solid-state NMR og DNP karakterisering. Lignende mærkning procedurer bør finde anvendelse på andre svampe med ændrede medium, og prøven forberedelse procedurer bør gælde generelt for andre kulhydratrige biomaterialer.

Protocol

1. vækst af 13C, 15N-mærket Aspergillus fumigatus flydende Medium Forberedelse af umærket og 13C, 15N-mærket vækstmedietBemærk: Begge gær Extract pepton Dextrose medium (YPD) og den forbedrede minimal medium43 blev brugt til vedligeholdelse af svampe kultur. Alle trin efter autoklavering er udført i en laminar flow hood at minimere forurening. Forberedelse af umærket flydende medium: opløses 6,5 g YPD pulver i 100…

Representative Results

Isotop mærkning væsentligt forbedrer NMR følsomhed og gør det muligt for måling af en serie af 2D 13C -13C og 13C -15N korrelation spectra at analysere sammensætningen, hydrering, mobilitet og pakning af polymerer, som vil blive integreret til at konstruere en tre-dimensionelle model af cellevæggen arkitektur (figur 1). Hvis den ensartede mærkning lykkes, et komplet sæt af 1D 13C og 15…

Discussion

Sammenlignet med de biokemiske metoder, har solid-state NMR fordele som en ikke-destruktiv og høj opløsning teknik. NMR er også kvantitative sammensætning analyse, og i modsætning til de fleste andre analysemetoder, gør ikke har usikkerheden indført af begrænset opløseligheden af Biopolymerer. Oprettelsen af den nuværende protokol letter fremtidige undersøgelser på kulhydratrige biomaterialer og functionalized polymerer. Dog skal det bemærkes, at resonans tildeling og data analyse kan være tidskrævende og …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem NSF OIA-1833040. Nationale høj magnetfelt Laboratory (NHMFL) er støttet af National Science Foundation gennem DMR-1157490 og staten Florida. MAS-DNP system på NHMFL er delvis finansieret af NIH S10 OD018519 og NSF CHE-1229170.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol – Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall – the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall – beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks – Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochimica. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochimica. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochimica. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin’s target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Fungal MaterialsPlant MaterialsSolid-state NMRDynamic Nuclear PolarizationBiomaterialsCarbohydratesFungal Cell WallsCell CultureYPD MediumLabeled Minimal MediumIsotope LabelingCarbon-13Nitrogen-15SterilizationAutoclaveCell Culture Techniques
check_url/it/59152?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image