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Biochimica

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर संरचनात्मक Elucidation के लिए कवक और संयंत्र सामग्री की तैयारी

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

बहुआयामी ठोस-राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (DNP) जांच के लिए 13सी,15एन-लेबल कवक और संयंत्र के नमूनों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे समान रूप से 13सी, 15N-लेबल कवक सामग्री का उत्पादन किया जा सकता है और कैसे इन नरम सामग्री ठोस राज्य एनएमआर और संवेदनशीलता-बढ़ाया DNP प्रयोगों के लिए रवाना किया जाना चाहिए । संयंत्र बायोमास के नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया भी विस्तृत है । इस विधि की एक श्रृंखला के माप की अनुमति देता है 1 डी और 2d 13c-13c/15N सहसंबंध्स स्पेक्ट्रा, जो उनके देशी राज्य में जटिल सामग्री के उच्च संकल्प संरचनात्मक elucidation सक्षम बनाता है, न्यूनतम गड़बड़ी के साथ. आइसोटोप-लेबलिंग 1 डी स्पेक्ट्रा में तीव्रता और 2d सहसंबंध स्पेक्ट्रा में ध्रुवीकरण हस्तांतरण दक्षता को बढ़ाता द्वारा जांच की जा सकती है । गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण की सफलता (DNP) नमूना तैयारी संवेदनशीलता बढ़ाने के कारक द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा polysaccharides और प्रोटीन के संरचनात्मक पहलुओं की जांच प्रयोगों तीन आयामी वास्तुकला का एक मॉडल के लिए नेतृत्व करेंगे । इन पद्धतियों को संशोधित और कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, पौधों की प्राकृतिक कोशिका दीवारें, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया, साथ ही साथ संश्लेषित या डिजाइन कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और अन्य के साथ उनके परिसर अणुओं.

Introduction

कार्बोहाइड्रेट ऊर्जा भंडारण, संरचनात्मक निर्माण, और सेलुलर मांयता और आसंजन के रूप में विभिंन जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । वे सेल की दीवार है, जो पौधों, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया1,2,3में एक मौलिक घटक है में समृद्ध कर रहे हैं । सेल दीवार जैव ईंधन और सामग्री के उत्पादन के लिए एक केंद्रीय स्रोत के रूप में कार्य करता है, साथ ही रोगाणुरोधी उपचार के लिए एक होनहार लक्ष्य4,5,6,7,8 , 9.

इन जटिल सामग्री की समकालीन समझ काफी है कि चार प्रमुख जैव रासायनिक या आनुवंशिक तरीकों का उपयोग संरचनात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए समर्पित किया गया प्रयासों के दशकों से उंनत किया गया है । पहला प्रमुख तरीका है अनुक्रमिक उपचार पर निर्भर करता है कठोर रसायनों या एंजाइमों का उपयोग करने के लिए नीचे अलग भागों, जो में शर्करा की संरचना और लिंकेज विश्लेषण के बाद है में सेल दीवारों को तोड़ने के प्रत्येक10अंश । यह विधि पॉलिमर के डोमेन वितरण पर प्रकाश डालता है, लेकिन व्याख्या जैव अणुओं के रासायनिक और भौतिक गुणों के कारण भ्रामक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि क्षार निकालने वाला अंश कम संरचित अणुओं के एक एकल डोमेन से या तुलनात्मक घुलनशीलता के साथ स्थानिक रूप से अलग अणुओं से उत्पन्न होता है या नहीं. दूसरा, निकाले गए भागों या पूरे सेल दीवारों को भी आबंध लिंकेज निर्धारित करने के लिए समाधान एनएमआर का उपयोग कर मापा जा सकता है, भी crosslinking के रूप में उद्धृत, विभिन्न अणुओं के बीच11,12,13, 14,15. इस तरह, आबंध एंकरों की विस्तृत संरचना की जांच की जा सकती है, लेकिन सीमाएं polysaccharides के कम घुलनशीलता के कारण मौजूद हो सकती हैं, crosslinking साइटों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या, और गैर-आबंध प्रभावों की अनभिज्ञता जो स्थिर होती है polysaccharide पैकिंग, जिसमें हाइड्रोजन-बॉन्डिंग, वान डेर Waals फोर्स, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरेक्शन और पॉलिमर उलझाव शामिल हैं । तीसरा, बाध्यकारी समानता अलग polysaccharides16,17,18,19का उपयोग कर इन विट्रो में निर्धारित किया गया है, लेकिन शुद्धि प्रक्रिया काफी बदल सकता है संरचना और इन अणुओं के गुण । इस विधि भी अणुओं के परिष्कृत जमाव और विधानसभा के बाद से दोहराने के लिए विफल रहता है । अंत में, phenotype, सेल आकृति विज्ञान और कुछ कोशिका दीवार घटक के तनु उत्पादन के साथ आनुवंशिक म्यूटेंट के यांत्रिक गुणों polysaccharides के संरचनात्मक कार्यों पर रोशनी शेड, लेकिन अधिक आणविक सबूत के लिए इन पुल की जरूरत है प्रोटीन मशीनरी20के इंजीनियर समारोह के साथ macroscopic टिप्पणियों ।

विकास और बहुआयामी ठोस राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन में हाल ही में अग्रिम इन संरचनात्मक पहेली को सुलझाने के लिए एक अनूठा अवसर पेश किया है । 2d/ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों देशी राज्य में कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की संरचना और वास्तुकला की उच्च संकल्प की जांच को सक्षम प्रमुख गड़बड़ी के बिना । संरचनात्मक अध्ययन सफलतापूर्वक दोनों प्राथमिक और माध्यमिक संयंत्रों के सेल दीवारों पर आयोजित किया गया है, उत्प्रेरक का इलाज बायोमास, बैक्टीरियल फिल्म, कवक में वर्णक भूत और, हाल ही में लेखकों द्वारा, एक रोगजनक कवक में बरकरार सेल दीवारों Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण का विकास (DNP)३२,३३,३४,३५,३६,३७,३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२ काफी DNP द्वारा संवेदनशीलता बढ़ाने के रूप में एनएमआर संरचनात्मक elucidation की सुविधा स्पष्ट रूप से इन जटिल सामग्री पर प्रयोगात्मक समय छोटा । प्रोटोकॉल यहां वर्णन किया गया आइसोटोप के लिए प्रक्रियाओं का विवरण-fumigatus और ठोस-राज्य एनएमआर और DNP लक्षण वर्णन के लिए कवक और संयंत्र नमूने तैयार कर रहा है । इसी तरह की लेबलिंग प्रक्रियाओं को बदल माध्यम के साथ अन्य कवक के लिए लागू किया जाना चाहिए, और नमूना तैयारी प्रक्रियाओं आम तौर पर अन्य कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री के लिए लागू किया जाना चाहिए.

Protocol

1. 13सी की वृद्धि, 15एन-त्यसपछि Aspergillus fumigatus तरल माध्यम अनलेबलिंग और 13सी, 15एन-लेबल ग्रोथ मीडियम की तैयारीनोट: दोनों खमीर निकालने Peptone डेक्सट्रोज मध्यम (YPD) और सुधार ंयूनतम मध्यम४३ …

Representative Results

लेबलिंग आइसोटोप काफी एनएमआर संवेदनशीलता को बढ़ाता है और यह 2 डी 13सी की एक श्रृंखला को मापने के लिए संभव बनाता है-13सी और 13सी-15N सहसंबंध स्पेक्ट्रा की संरचना, जलयोजन, गतिशीलता औ?…

Discussion

जैव रासायनिक तरीकों के साथ तुलना में, ठोस राज्य एनएमआर एक गैर विनाशकारी और उच्च संकल्प तकनीक के रूप में लाभ है । एनएमआर संरचना विश्लेषण में भी मात्रात्मक है, और सबसे अंय विश्लेषणात्मक तरीकों के विपरीत, …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा NSF OIA-१८३३०४० के माध्यम से समर्थन दिया गया । राष्ट्रीय उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रयोगशाला (NHMFL) DMR के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है-११५७४९० और फ्लोरिडा के राज्य । MAS-DNP प्रणाली NHMFL में NIH S10 OD018519 और NSF चे-१२२९१७० द्वारा भाग में वित्त पोषित है ।

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
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