Utarbeidelsen av sopp og plantemateriale for strukturelle Elucidation bruker dynamiske kjernefysiske polarisering SSD NMR

Summary

En protokoll for å forberede ¹³C,¹⁵N-merket sopp og plante prøver for flerdimensjonale SSD NMR spektroskopi og dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP) undersøkelser er presentert.

Abstract

Denne protokollen viser hvordan jevnt ¹³C, ¹⁵N-merket fungal materialer kan være produsert og hvordan disse myke materialer bør bli fortsatte for SSD NMR og følsomhet forbedret DNP eksperimenter. Eksempel behandling prosedyren av anlegget biomasse er også detaljert. Denne metoden kan måling av en rekke 1D- og 2D ¹³C –¹³C /¹⁵N sammenhenger spectra, som gir høy oppløsning strukturelle utviklingen av kompleks biologisk materiale i sin opprinnelige tilstand, med minimal forstyrrelsene. Isotop-merking kan undersøkes av kvantifisere intensiteten i 1D spectra og polarisering overføring effektiviteten i 2D korrelasjon spectra. Suksessen til dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP) eksempel forberedelse kan evalueres med følsomhet ekstrautstyr faktor. Ytterligere eksperimenter undersøke de strukturelle aspektene av polysakkarider og proteiner vil føre til en modell av tredimensjonale arkitektur. Disse metodene kan endres og tilpasset for å undersøke en rekke karbohydrat-rik materialer, inkludert naturlig cellen vegger av, sopp, alger og bakterier, samt syntetisk eller karbohydrater polymerer og deres kompleks med andre molekyler.

Introduction

Karbohydrater spille en sentral rolle i ulike biologiske prosesser som energilagring, strukturelle bygningen, og mobilnettet anerkjennelse og vedheft. De er beriket i celleveggen, som er en grunnleggende komponent i, sopp, alger og bakterier^1,2,3. Cellen vegg fungerer som en sentral kilde for produksjon av biodrivstoff og biologisk materiale, samt en lovende mål for antimikrobielle behandlinger,^4,,^5,,^6,,^7,,^{8 , 9}.

Den moderne forståelsen av disse komplekse materialer har blitt vesentlig avanserte av tiår med innsats som var viet til strukturelle karakterisering ved hjelp av fire store biokjemiske eller genetiske metoder. Den første store metoden avhenger av sekvensiell behandlinger bruker sterke kjemikalier eller enzymer bryte ned cellen vegger i ulike deler, som er etterfulgt av komposisjonelle og koblingsanalyse av sukker i hver fraksjon¹⁰. Denne metoden belyser domene fordelingen av polymerer, men tolkningen kan det være misvisende på grunn av de kjemiske og fysiske egenskapene av biomolecules. For eksempel er det vanskelig å avgjøre om alkaliske-utvinnbare brøken stammer fra ett enkelt domene mindre strukturert molekyler eller romlig atskilt molekyler med sammenlignbare oppløselighet. Andre utdraget deler eller hele cellen vegger kan også måles bruker løsning NMR for å avgjøre kovalente sammenhengen, også betegnet som crosslinking, mellom ulike molekyler^{11,12,13, 14,15}. På denne måten detaljert strukturen i kovalente ankere kan bli undersøkt, men begrensninger finnes p.g.a. lav oppløselighet av polysakkarider, relativt lite antall crosslinking områder og uvitenhet av ikke-kovalente effekter som stabiliserer polysakkarid pakking, inkludert hydrogen-binding, van der Waals kraft, elektrostatiske samhandling og polymer forviklinger. Tredje er forpliktende tilhørighet bestemt i vitro bruke isolert polysakkarider^16,17,18,19, men rensing prosedyrer kan vesentlig endre strukturen og egenskapene til disse biomolecules. Denne metoden likeledes svikter å gjenskape sofistikert avsettelse og montering av makromolekyler etter biosyntesen. Til slutt, fenotype, celle morfologi og mekaniske egenskaper av genetisk mutanter med dempes produksjonen av visse cellen vegg komponent kaste lys på strukturelle funksjoner av polysakkarider, men mer molekylær bevis er nødvendig å bygge bro disse makroskopisk observasjoner med funksjonen utviklet av protein machineries²⁰.

Nylige fremskritt innen utvikling og anvendelse av flerdimensjonale SSD NMR spektroskopi har innført en unik mulighet for å løse disse strukturell oppgaver. 2D/3D SSD NMR eksperimenter aktivere høyoppløselig undersøkelse av sammensetningen og arkitektur av karbohydrat-rik materialer i den opprinnelige tilstanden uten store forstyrrelsene. Strukturelle undersøkelser har blitt vellykket utført både primær og sekundær cellevegger av planter, katalytisk behandlet biomasse, bakteriell biofilm, pigment spøkelser i sopp og nylig av forfatterne, intakt cellen vegger i en sykdomsfremkallende sopp Aspergillus fumigatus ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31}. utvikling av dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP)^{32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42} muliggjør vesentlig NMR strukturelle forklaring som følsomhet styrking av DNP markert Skadetiden eksperimentelle på disse komplekse biologisk materiale. Protokollen beskrevet her detaljer prosedyrer for isotop-merking soppen A. fumigatus og forbereder sopp og plante prøver for SSD NMR og DNP karakterisering. Lignende fremgangsmåter som merking skal gjelder for andre sopp med endrede medium, og eksempel forberedelse prosedyrer bør være generelt gjelder for andre karbohydrat-rik biologisk materiale.

Protocol

1. vekst 13C, 15N-merket Aspergillus fumigatus flytende Medium Utarbeidelse av umerkede og 13C, 15N-merket oppblomstringen mediumMerk: Begge gjær ekstra pepton druesukker medium (YPD) og den forbedrede minimal middels43 ble brukt for vedlikehold av sopp kultur. Alle trinnene etter autoklavering utføres laminær strømning hette å redusere forurensning. Utarbeidelse av umerkede flytende medium: oppløse 6.5 g av YPD pulve…

Representative Results

Isotop merkingen vesentlig forbedrer NMR følsomheten og gjør det mulig for å måle en rekke 2D 13C -13C og 13C -15N korrelasjon spectra analysere komposisjon, hydration, mobilitet og pakking av polymerer, som vil bli integrert for å konstruere en tredimensjonal modell av cellevegg arkitektur (figur 1). Hvis uniform merkingen lykkes, et komplett sett av 1D 13C og 15N spectra kan samles i 1 t…

Discussion

Sammenlignet med metodene biokjemiske, har SSD NMR fordeler som en ikke-destruktiv og høy oppløsning teknikk. NMR er også kvantitative kompositoriske analyse, og i motsetning til de fleste andre analytiske metoder, gjør ikke har usikkerhet introdusert av begrenset Løseligheten av biopolymers. Etablering av gjeldende protokollen forenkler fremtidige studier på karbohydrater-rik biologisk materiale og functionalized polymerer. Det bør imidlertid bemerkes at resonans tildeling og data analyse kan være tidkrevende og…

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
Analytical weighing balance	Ohaus	B730439218	Model PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Biosafety Cabinet	Labconco corporation	302319100
Boric acid	VWR	BDH9222	store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE shaking incubator	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 atom % D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 atom % D
d8-glycerol	Sigma Aldrich	447498	≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa	Sigma Aldrich	D2272	132724
Dipotassium Phosphate	VWR	BDH9266	≥98 %
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fischer Scientific	750004271	Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit	Bruker	B4493	Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate	VWR	10034998	store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate	Alfa Aesar	11563	≥99 %
Monopotassium Phosphate	VWR	470302-254	≥99 %
pH Meter	Mettler Toledo	B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-glycerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor	Cortecnet	B6939
3.2 mm Silicone plug	Bruker	B7089
4 mm MAS Rotor Kit	Bruker	H14355	Zirconia