Her forklares i detaljer protokoller til udførelse af MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging af tre Marine hvirvelløse dyr. Denne undersøgelse beskriver trin som prøve fiksering, farvning, montage, scanning, billed rekonstruktion og dataanalyser. Der gives også forslag til, hvordan protokollen kan justeres for forskellige prøver.
Traditionelt har biologer måttet forlade sig på destruktive metoder såsom skæring for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Ikke-destruktiv MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging er blevet en kraftfuld og fremspirende protokol i biologi, på grund af teknologiske fremskridt i prøve farvning metoder og innovationer i microCT hardware, behandling af computere, og data Analysis software. Men denne protokol er ikke almindeligt anvendt, som det er på det medicinske og industrielle områder. En af årsagerne til denne begrænsede brug er manglen på en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt: prøveindsamling, fiksering, farvning, monteringen, scanning, og dataanalyser. En anden grund er den store mangfoldighed af metazoanere, især Marine hvirvelløse dyr. På grund af hvirvelløse vanddyr ‘ forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier er det afgørende at justere eksperimentelle forhold og hardwarekonfigurationer på hvert trin, afhængigt af prøven. Her forklares Mikroct-billedbehandlings metoder i detaljer ved hjælp af tre Fylogenetisk mangfoldige Marine hvirvelløse dyr: Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA), Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) og xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Forslag til udførelse microCT Imaging på forskellige dyr er også forudsat.
Biologiske forskere generelt har måttet gøre tynde sektioner og udføre observationer af lys eller elektronmikroskopi for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Disse metoder er imidlertid destruktive og problematiske, når de anvendes på sjældne eller værdifulde prøver. Desuden er flere trin i metoden, såsom indlejring og skæring, tidskrævende, og det kan tage flere dage at observere en prøve, afhængigt af protokollen. Desuden, ved håndtering af talrige sektioner, er der altid en mulighed for at beskadige eller miste nogle sektioner. Vævs clearing teknikker er tilgængelige for nogle enheder1,2,3,4,5 , men er endnu ikke gældende for mange dyrearter.
For at overvinde disse problemer, nogle biologer er begyndt at bruge MicroFocus X-ray computertomografi (microct) billeddannelse6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I røntgen CT er præparatet bestrålet med røntgenstråler fra forskellige vinkler, der genereres fra en røntgenstråle kilde, som bevæger sig rundt i prøven, og de transmitterede røntgenstråler overvåges af en detektor, der også bevæger sig rundt i prøven. De opnåede røntgen transmissions data analyseres for at rekonstruere tværsnitsbilleder af præparatet. Denne metode gør det muligt at observere interne strukturer uden at ødelægge prøven. På grund af sin sikkerhed og lethed, det er almindeligt anvendt i medicinsk og dental applikationer, og CT-systemer kan findes i hospitaler og dental centre i hele verden. Desuden anvendes industrielt røntgen-CT hyppigt til observation af ikke-medicinske prøver til inspektion og metrologi på industriområdet. I modsætning til medicinsk CT, hvor røntgen kilden og detektorerne er mobile, er de to dele fastgjort i industriel CT, hvor prøven roterer under scanningen. Industriel CT generelt producerer højere opløsning billeder end medicinsk CT og omtales som microCT (micrometer-level resolution) eller nanoCT (nanometer-niveau opløsning). For nylig, forskning ved hjælp af microct er hurtigt steget inden for forskellige områder af biologi14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologiske undersøgelser ved hjælp af CT oprindeligt målrettede interne strukturer, der hovedsagelig består af hårdt væv, såsom knogle. Fremskridt i farvningsteknikker ved hjælp af forskellige kemiske agenser muliggjorde visualisering af blødt væv i forskellige organismer6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. af disse reagenser er jod-baserede kontrastmidler relativt sikre, billige og kan anvendes til visualisering af blødt væv i forskellige organismer7,14. Med hensyn til hvirvelløse Marine dyr er microct i vid udstrækning blevet anvendt på sådanne dyr som bløddyr6,25,32,33, Ledorme18,19, 20 , 28, og arthoropods21,23,29,31. Der har dog været få rapporter om andre animalske phyla, såsom bryozoans6, xenacoelomorphs26, og cnidarians24,30. Generelt har der været færre studier med Mikroct på hvirvelløse havdyr end på hvirveldyr. En væsentlig årsag til denne begrænsede brug af hvirvelløse havdyr er den store diversitet, der observeres i disse dyr. På grund af deres forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier, reagerer hver art forskelligt på forskellige eksperimentelle procedurer. Det er derfor afgørende under prøveforberedelsen at vælge det mest hensigtsmæssige fikserings-og farvnings reagens og at fastsætte betingelser for hvert trin, justeret for hver art. På samme måde er det også nødvendigt at indstille scannings konfigurationerne, såsom monteringsmetode, spænding, aktuel, mekanisk forstørrelsesgrad og rumopløsnings kraften, passende for hver prøve. For at løse dette problem, en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt, forklarer, hvordan hvert trin kan justeres afhængigt af prøven, og viser detaljerede eksempler fra flere prøver er afgørende.
I denne undersøgelse beskriver vi Mikroct Imaging Protocol trin-for-trin, fra prøve fiksering til dataanalyse, ved hjælp af tre Marine hvirvelløse arter. Prøver af havanemone Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA) blev indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. De havde en sfærisk, blød krop, der var omkring 2 cm i diameter (figur 1a-C). Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) prøver blev også indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station. De var slanke orme, der var omkring 1,5 cm i længden, med hårde chaetae til stede langs hele kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prøveeksemplar blev samlet i nærheden af Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, under den 13. Det var en soft-bodied orm, der var omkring 0,8 cm i længden (figur 1E). Justeringer for de enkelte prøvens betingelser og konfigurationer forklares i detaljer. Vores undersøgelse giver flere forslag til, hvordan man udfører microCT Imaging på marine invertebrater, og vi håber, at det vil inspirere biologer til at udnytte denne protokol til deres forskning.
Fikater, der anvender formalin, såsom 10% (v/v) formalin-opløsningen i havvand, som anvendes i dette studie, er kendt for at bevare morfologien af forskellige Marine hvirvelløse dyr og anvendes ofte til mikroct-billeddannelse18,24,25 ,26,28,30,33. Begrænsningerne i anvendelsen af dette …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Toshihiko Shiroishi for hans hjælp og for at tilvejebringe forskningsmiljøet under denne undersøgelse. Vi er taknemmelige for Kensuke Yanagi og Takato Izumi for rådgivning om a. equinaog Masaatsu Tanaka til rådgivning om Harmothoe Sp.-prøven. Vi vil gerne takke personalet på Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba og Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo for deres hjælp i prøve samlinger. Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS-støtten til unge videnskabsmænd (A) (JP26711022) til HN og JAMBIO, den japanske forening for havbiologi.
250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
Razor blades | Feather | FA-10 | |
Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |