Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.
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Articolo metodologico
Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel sistema nervoso, della mielina è una struttura complessa membrana generata da myelinating glial cells, cui assoni di ensheathes e facilita la conduzione elettrica. Alterazione della mielina è stato indicato per accadere in varie malattie neurologiche, dove è associato con i deficit funzionali. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un ex vivo modello composto da fette organotipiche cerebellari del topo, che possono essere mantenute in coltura per diverse settimane e più ulteriormente essere etichettati per visualizzare la mielina.
Introduzione
I neuroni sono cellule altamente polarizzate, che comprendono un vano somato-dendritica che riceve gli input dal suo ambiente e un assone che assicura la generazione e la propagazione di impulsi elettrici ad altre cellule. Propagazione rapida e tempestiva consegna delle informazioni è essenziale per il corretto funzionamento del sistema nervoso. Nei vertebrati, esso è facilitato dalla mielinizzazione, che permette di aumentare la velocità di conduzione assonale1. Mielina è una struttura specializzata formata da strati compattati della membrana di plasma generato dalla glia myelinating, vale a dire gli oligodendrociti nel sistema nervoso central....
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Protocollo
Tutti i lavori che coinvolgono gli animali è conformato da politiche istituzionali e linee guida stabilite dall'UPMC, INSERM e il francese e la direttiva comunitaria del Consiglio 86/609/CEE.
1. preparazione del terreno di coltura e cultura inserti (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)
Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso cultura in condizioni sterili
- Preparare 40 mL di terreno di coltura, che è costituito da 50% BME, soluzione salina bilanciata di 25% Hank (1x), 25% inattivati al calore cavallo del siero, completato con derivato di glutamina 2mm, 100 UI/mL penicillina-strepto....
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Risultati
Esempi di immunostainings rappresentante della mielina in organotipiche cerebellari fette ottenute da P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (Figura 2A), così come topi transgenici PLP-GFP (Figura 2B), insieme alle cellule di Purkinje macchiatura. Mielinare da materia bianca cerebellare fette canzoni regione delle fette verso la periferia della folia e mielinizzazione delle cellule del Purkinje è per lo più raggiunto dopo 6 o 7 DIV. A 7.......
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Discussione
Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare un ex vivo modello corrispondente alle culture del mouse organotipiche cerebellari fetta, adattato da precedentemente metodi pubblicati15,16,19 e la mielina successiva immunostaining di questi preparati. Questa strategia offre la possibilità di visualizzare componenti della mielina con una risoluzione elevata negli stati sani e patologici.
Tratto da 10.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux per i preziosi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, ICM, ARSEP sovvenzioni R13123DD, ANR R17127DD (al D.C.) e FRM fellowship, SPF20110421435 (al D.C.), FDT20170437332 (di M.T.). Ringraziamo la struttura di cultura cellulare CELIS e l'icm. Piattaforma di imaging quant.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BME medio | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Siero di cavallo inattivato termicamente | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillina... Streptomicina (10.000 UI/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey' s Soluzione salina bilanciata | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| Soluzione di D-glucosio (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldeide (PFA) | Microscopia elettronica Scienze | 15714 | |
| Etanolo assoluto (100% etanolo) | VWR Chemicals | 20821.330 | Raffreddato a -20 gradi C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% siero di capra normale (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| soluzione tampone fosfato | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anticorpo anti-GFP (policlonale, pollo) | Merck Millipore | 06-896 | Diluizione 1/300 |
| Anticorpo anti-proteina basica della mielina (MBP) (policlonale, pollo) | Merck Millipore | AB9348 | Diluizione 1/150 |
| Anticorpo anti-proteina basica della mielina (MBP) (monoclonale, IgG2b di topo) | Merck Millipore | NE1019 | Diluizione 1/200 |
| Anticorpo anti-PLP (ratto, ibridoma) | Dono del Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Giappone | Diluizione da 1/5 a 1/10 | |
| Anti-Canale del Sodio, Anticorpo Pan (Monoclonale, IgG1 di topo, clone K58/35) | Diluizione Sigma Aldrich | S8809 | 1/150 |
| Anticorpo Anti-Caspr (Policlonale, Coniglio) | Abcam | ab34151 | Diluizione 1/500 |
| Anticorpi secondari di capra coniugati ad Alexa Fluor 488, 594, 647 o 405 | scientifica ThermoFisher 1 | /500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tritatessuti | McIlwain | ||
| Lame di | |||
| Forbici grandi | FST | 14101-14 | |
| Forbici piccole | FST | 91500-09 | |
| Pinze dritte fini | FST | 91150-20 | |
| Pinze curve e fini | F.S.T | 11297-00 | |
| Piastre per colture cellulari (60 mm e 100 mm) | Piastre per colture TPP | ||
| a 4, 6 pozzetti | TPP | ||
| Inserti per colture millicellulari (0,4 &; micro; m, diametro 30 mm) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Incubatore | 37° C, 5% CO2 | ||
| Puntali per pipette a estremità fine | Dutscher | 134000CL | |
| Puntali per pipette a foro largo | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Siringa sterile | Terumo Europe | 20 o 50 mL | |
| Filtri per siringa sterili | Terumo Europe | 0,22 &; m | |
| Bisturi | Swann-Morton | 0510 | |
| Vetrini per microscopio | |||
| Vetrini coprioggetti | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tergicristalli per tessuti | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Microscopio | binoculare |
Riferimenti
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple scleros....
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Ristampe e permessi
