Cytometric flowmåling af ROS produktion i makrofager i svar til FcγR tværbinding
Summary
Denne undersøgelse viser brugen af flowcytometri at opdage reaktive ilt arter (ROS) produktion som følge af aktivering af FcγR. Denne metode kan bruges til at vurdere ændringer i antimikrobielle og redox signalering funktion af fagocytter reaktion på immunkomplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.
Abstract
Den oxidative eller respiratoriske burst bruges til at beskrive den hurtige forbrug af ilt og generation af reaktive ilt arter (ROS) af fagocytter svar på forskellige immun stimuli. ROS genereret i løbet af immun aktivering udøver potent antimikrobiel aktivitet primært gennem ROS evne til at skade DNA og proteiner, forårsager død af mikroorganismer. At være i stand til at måle ROS produktion reproducerbar og med lethed er nødvendige for at vurdere de forskellige veje og molekyler til denne mekanisme af vært forsvar bidrag. I dette papir, vi demonstrere brugen af fluorescerende sonder og flow flowcytometri ægprodukters ROS produktion. Selv om udbredt, er fluorescerende måling af ROS notorisk problematisk, især med hensyn til måling af ROS induceret af specifikke og ikke mitogenic stimuli. Vi præsenterer en detaljeret metode til at registrere ROS genereret som følge af specifikke FcγR stimulation begynder med makrofag generation, priming, farvning, FcγR cross-linking og slutter med flow cytometric analyse.
Introduction
Reaktive ilt arter (ROS) er reaktiv molekyler eller frie radikaler, der er biprodukter af aerob respiration (gennemgik i 1). Disse omfatter superoxid-anion, peroxid, hydrogenperoxid, hydroxyl radikale og hydroxyl-ioner, blandt andre. Under normale fysiologiske, ROS fremstilles hovedsagelig af mitokondrier og nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH) oxidases og er hurtigt detoksi-forskellige enzymer og proteiner såsom superoxiddismutase og glutathion. En overdreven produktion af ROS eller en defekt i evnen til at fjerne ROS kan føre til oxidativ stress, hvorved reaktive ilt arter fremme beskadigelse af proteiner, lipider og DNA fører til cellulært stress eller død og patologiske sygdomstilstande. Men det er i øjeblikket værdsat at ROS kan også fungere som signaling molekyler (redox signalering), og ROS-medieret ændring af forskellige molekyler og pathway mellemprodukter kan påvirke cellulære metabolisme, spredning, overlevelse, inflammatoriske signalering, og aging2. I fagocyterende celler spiller ROS en afgørende rolle i forbindelse med antimikrobiel aktivitet under den såkaldte “respiratoriske burst”1,3,4,5,6. Under fagocytter reaktion på eksterne stimuli translocate komponenter af NADPH oxidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra cytosol til den phagosomal membran, der indeholder gp91phox og p22phox underenheder, og sammen med Rac1/2 handlinger udgør en fuldt funktionel NADPH oxidase enzym kompleks. De forsamlede NADPH oxidase derefter benytter NADPH til at reducere ilt til superoxid inden for den phagosomal vakuole. Superoxid anioner kan direkte skade eller være dismutated i brintoverilte. Både superoxid og brintoverilte kan reagere med andre molekyler til at generere meget reaktive hydroxylradikaler. Skader er medieret af reaktion af disse ROS med jern-svovl klynger på proteiner eller forårsager base oxidation af DNA, i sidste ende fører til begrænset mikrobiel metabolisme eller død af mikrobe5. Betydningen af NADPH oxidase enzym kompleks og ROS produceret under den respiratoriske burst illustreres klinisk hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD besidder mutationer i gp91phox, hvilket resulterer i en mangel på ROS produktion og modtagelighed for tilbagevendende infektioner med bakterier og svampe, der ikke er normalt en bekymring med immunkompetente enkeltpersoner. Derfor om at studere oxidativ stress, redox signalering eller vært forsvar, at være i stand til at måle er ROS produktion i realtid en nyttig bestræbelse.
Flere assays har været udnyttet til foranstaltning ROS produktion eller resultaterne af oxidativt stress11,12,13. Blandt disse er en af de mest anvendte fluorescerende sonde 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Dette molekyle er farveløs og lipofile. Udbredelse af DCFH2-DA over cellemembranen tillader det at blive fulgt op af intracellulære esteraser, som deacetylates det i DCFH2, rendering det celle uigennemtrængelige. Handlinger af flere typer af ROS (brintoverilte, peroxynitrite, hydroxylradikaler, nitrogenoxid og peroxyradikaler) på DCFH2 oxidere det i DCF, der er fluorescerende (rapporteret Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan registreres ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en standard filter sat til fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerer ikke stærkt med DCFH2 men kan reagere med en anden sonde dihydroethidium (DHE) at give fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxid-uafhængig oxidation produkter)15. De fluorescerende produkter af DHE oxidation kan påvises ved hjælp af en excitation boelgelaengden 518 nm og en emission boelgelaengden 605 nm (FL2 kanal). Selvom relativt enkel at bruge, kræver udnyttelse af disse sonder for opdagelse af ROS viden om deres begrænsninger og passe iblanding farvning procedurer og kontrol i specifikke analysen udføres for at have gyldig eksperimentelle resultater og konklusioner. Følgende protokol viser brugen af et kommercielt tilgængeligt kit beskæftiger disse 2 sonder designet til at måle ROS ved flowcytometri. Vi pletten PRIMES knoglemarv-afledte makrofager med disse sonder og fremkalde ROS produktion gennem FcγR cross-linking. Vi præsentere repræsentative data opnået ved hjælp af denne protokol og understrege passende forholdsregler, der skal gennemføres for vellykkede eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA og DHE-baseret detektion af ROS er en meget udbredt teknik14,15. Brugervenlighed og tilpasningsevne af disse ROS sonder til kinetic mikrotiterplade formater, Fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidraget til deres popularitet. Men i vores studier af FcγR-medieret makrofag funktioner, der ikke syntes at være en standardprotokol til at udføre denne analyse for flow cytometric analyse af FcγR krydsbundet celler. Givet den …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke andre medlemmer af Tigno-Aranjuez Lab herunder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjælp i laboratoriet vedligeholdelse og mus koloni vedligeholdelse. Support af denne forskning blev leveret af grant R00 HL122365 og Start-up midler til J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
