Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.
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Articolo metodologico
In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'organismo modello C. elegans fornisce un ottimo sistema per eseguire l'imaging in vivo del calcio. Il suo corpo trasparente e la sua manipolabilità genetica consentono l'espressione mirata di sensori di calcio geneticamente codificati. Questo protocollo delinea l'uso di questi sensori per l'imaging in vivo della dinamica del calcio nelle cellule mirate, in particolare i muscoli della parete corporea dei vermi. Utilizzando la co-espressione della channelrhodopsin presintica, la stimolazione del rilascio dell'acetilcolina dai motoneuroni eccitatori può essere indotta utilizzando impulsi di luce blu, con conseguente depolarizzazione muscolare e cambiamenti riproducibili nel calcio citoplastico Livelli. Due tecniche di immobilizzazione dei vermi sono discusse con diversi livelli di difficoltà. Il confronto di queste tecniche dimostra che entrambi gli approcci preservano la fisiologia della giunzione neuromuscolare e consentono la quantificazione riproducibile dei transitori di calcio. Associando l'optogenetica e l'imaging funzionale del calcio, i cambiamenti nella manipolazione post-sinaptica del calcio e nell'omeostasi possono essere valutati in una varietà di background mutanti. I dati presentati convalidano entrambe le tecniche di immobilizzazione ed esaminano specificamente i ruoli del c. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase e il canale di potassio BK attivato dal calcio nella regolazione del calcio muscolare della parete corporea.
Introduzione
Questo articolo presenta metodi per l'imaging del calcio in vivo dei muscoli della parete corporea di C. elegans utilizzando la stimolazione neuronale optogenetica. L'associazione di un muscolo ha espresso indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) con la depolarizzazione neuronale innescata dalla luce blu e fornisce un sistema per osservare chiaramente i transitori di calcio postsinaptico evocati. Questo evita l'uso della stimolazione elettrica, consentendo un'analisi non invasiva dei mutanti che influenzano la dinamica post-sinaptica del calcio.
I GECI a singolo fluoroforo, come GCaMP, utilizzano una singola molecola pr....
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Protocollo
1. Configurazione del microscopio
- Utilizzare un microscopio composto con capacità di fluorescenza. Per questo studio, sono stati raccolti dati su un microscopio verticale (Tabella dei materiali) dotato di LED per l'eccitazione.
- Al fine di visualizzare correttamente i cambiamenti di fluorescenza nei muscoli della parete del corpo, utilizzare un obiettivo di ingrandimento elevato.
- Per i preparati sezionati, utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x NA 1.0 (Tabella dei materiali).
- Per i preparati utilizzino nanosfere, utilizzare un obiettivo di immersione dell'olio 60x NA 1.4 (Tabel....
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Risultati
Questa tecnica ha valutato i cambiamenti nei mutanti che si ritiene influenzino la manipolazione del calcio o la depolarizzazione muscolare. Sono stati visualizzati i livelli di fluorescenza di base e i transitori fluorescenti e sono stati valutati il calcio citosolico a riposo e la cinetica di calcio all'interno del muscolo. È importante che gli animali siano stati coltivati su una retina tutta trans per almeno tre giorni per garantire la corretta incorporazione della retina, attivando c.......
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Discussione
I GECI sono un potente strumento nella neurobiologia di C. elegans. Il lavoro precedente ha utilizzato tecniche di imaging del calcio per esaminare un'ampia varietà di funzioni sia nei neuroni che nelle cellule muscolari, comprese le risposte sensoriali e comportamentali, con vari metodi di stimolazione. Alcuni studi hanno utilizzato stimoli chimici per innescare transitori di calcio nei neuroni sensoriali ASH22,23 o per indurre le onde di calcio nei mus.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Alexander Gottschalk per la SX1659, la RCaMP e la channelrhodopsin contenente ceppo di verme, dr. Hongkyun Kim per il ceppo di vermi slo-1(eg142) e il National Bioresource Project per il ceppo di vermi sca-1(tm5339).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| all-trans retinico | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessario per l'eccitazione del canale rodopsina |
| Ambra LED | RCaMP illuminazione | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controlla l'illuminazione a fluorescenza |
| blu | illuminazione a canale rodopsina | ||
| BX51WI microscopio | Olympus | Microscopio composto a stato fisso | |
| Alimentatore lineare a basso rumore a corrente controllata | Ametek | Sorenson | Controlli Intensità LED |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Software grafico |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Software di elaborazione delle immagini |
| LUMFLN 60x acqua NA 1.4 | Olympus | Obiettivo ad immersione in acqua per preparazione sezionata | |
| Stimolatore Master-8 | A.M.P.I | Master timer per l'acquisizione delle immagini e l'illuminazione a LED | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controlli l'acquisizione della telecamera e l'eccitazione dei LED | |
| Microsoft Excel | Microsoft Spreadsheet software | ||
| pco.edge 4.2 CMOS | pco. | 4.2 | Fotocamera ad alta velocità PlanApo |
| N 60x olio NA 1.4 | Olympus | Obiettivo a immersione in olio per la preparazione di nanosfere | |
| Microsfere | Polybeads Polysciences, Inc. | 00876-15 | per immobilizzazione a vite senza fine |
| Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controlli sulla temporizzazione dell'illuminazione a LED | |
| Ceppo transgenico, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | SY1627 | Canale neuronale eccitatorio rodopsina e muscolo della parete corporea RCaMP che esprime la linea di verme con allele mutante SERCA |
| Ceppo transgenico, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | Canale neuronale eccitatorio rodopsina e muscolo della parete corporea RCaMP che esprime la linea del verme con allele mutante del canale del potassio BK attivato dal calcio | |
| Ceppo transgenico, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Gottschalk Lab | ZX1659 | Canale neuronale eccitatorio rodopsina e muscolo della parete corporea RCaMP che esprime la linea del verme |
Riferimenti
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. G....
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Ristampe e permessi
