Præcis offentliggørelse af metoder og protokoller er afgørende for en storstilet udbredelse af stamcelleterapier. Her præsenterer vi en protokol til isolering af fedtafledte regenerative celler, der anvendes til en enkelt intracavernøs injektion som behandling af erektil dysfunktion (ED) efter radikal prostatektomi (RP).
Stamceller anvendes i mange forskningsområder inden for regenerativ medicin, dels fordi disse behandlinger kan være helbredende snarere end symptomatiske. Stamceller kan fås fra forskellige væv, og flere metoder til isolering er blevet beskrevet. Den præsenterede metode til isolering af fedtafledte regenerative celler (ADRC’er) kan anvendes inden for mange terapeutiske områder, fordi metoden er en generel procedure og derfor ikke begrænset til behandling af erektil dysfunktion (ED). ED er en almindelig og alvorlig bivirkning til radikal prostatektomi (RP), da ED ofte ikke behandles godt med konventionel terapi. Brug af ADRC’er som behandling for ED har tiltrukket stor interesse på grund af de indledende positive resultater efter en enkelt injektion af celler i corpora cavernosum. Metoden til isolering af ADRC’er er en enkel, automatiseret proces, der er reproducerbar og sikrer et ensartet produkt. Desuden sikres steriliteten af det isolerede produkt, fordi hele processen foregår i et lukket system. Det er vigtigt at minimere risikoen for forurening og infektion, da stamcellerne bruges til injektion hos mennesker. Hele proceduren kan udføres inden for 2,5-3,5 timer og kræver ikke et klassificeret laboratorium, hvilket eliminerer behovet for at sende væv til et off-site. Proceduren har dog nogle begrænsninger, da den mindste mængde drænet lipoaspirat for at isolationsanordningen kan fungere er 100 g.
Stamceller har evnen til at differentiere sig til forskellige celletyper, og de udskiller parakrine faktorer, der menes at fremme helingsprocessen i beskadiget væv 1,2,3,4. De er derfor attraktive inden for regenerativ medicin, fordi de kan repræsentere en mulig helbredende behandling.
Radikal prostatektomi (RP) er den gyldne helbredende behandling til patienter med lav / mellemliggende risiko lokaliseret prostatakræft og en forventet levetid > 10 år. Formålet med operationen er udryddelse af kræften, men den har flere bivirkninger. Forekomsten af post-prostatektomi inkontinens varierer fra 2-60%, og erektil dysfunktion (ED) opleves af 20-90% af patienterne5. Nervebesparende teknik er en mulighed hos nogle patienter (Gleason score < 7, lav risiko for ekstrakapsulær sygdom)5. Denne teknik skåner nerverne, der er ansvarlige for erektion, men selvom dette er muligt, rapporterer mange patienter stadig ED postoperativt.
Behandlingsmuligheder for penisrehabilitering efter RP består primært af behandling med PDE-5-hæmmere, injektions- eller instillationsterapi og vakuumpumper. Lægemidler, der anvendes til penisrehabilitering, adskiller sig farmakologisk, men deres virkningsmekanisme omfatter afslapning af de glatte muskelceller i corpus cavernosum. Mange patienter oplever dog behandlingssvigt og opnår aldrig en effekt af medicinen, der muliggør samleje6.
ED, der opstår efter RP, menes at skyldes strukturelt irreversible ændringer7. Disse ændringer forekommer i det kavernøse væv og omfatter apoptose af de glatte muskel- og endotelceller og fibrose. Den veno-okklusive mekanisme, der er ansvarlig for en central del af erektionen, svækkes af ændringerne, hvilket resulterer i dårligere fyldning og hårdhed af penis7.
Mange af patienterne rapporterer, at den ED, de oplever, har en negativ indvirkning på deres livskvalitet8. De er ikke klar til at opgive deres seksuelle aktivitet efter operationen, og derfor er en helbredende terapi til ED attraktiv, når de andre tilgængelige behandlinger til penisrehabilitering mislykkes.
I tidligere forsøg, herunder dyreforsøg og små fase 1-forsøg på mennesker, har stamceller vist lovende resultater som en alternativ behandling for ED 2,9,10,11,12. Resultaterne viser, at det er sikkert at bruge ADRC’er, og at den erektile funktion forbedres signifikant efter en enkelt injektion i corpora cavernosum 2,9,10,11,12. Fedtafledte regenerative celler (ADRC’er) menes at understøtte vævsregenerering ved hjælp af parakrine mekanismer gennem frigørelse af flere hormoner, neurotrofiske og andre vækstfaktorer, cytokiner og muligvis mikro-RNA’er13. Derudover er ADRC’er i stand til at differentiere sig i flere modne celletyper, herunder endotel- og vaskulære muskelceller, bruskceller, osteocytter og neuroner14,15. Disse egenskaber gør stamceller interessante for at udvikle en permanent ny behandling for ED.
Stamceller er opdelt i flere grupper, dybest set dem, der stammer fra det tidlige embryo (embryonale stamceller) og dem fra voksent væv (voksne stamceller). Voksne stamceller omfatter mesenkymale stamceller (MSC), der er multipotente og kan findes i knoglemarv, fedtvæv, navlestrengsblod, moderkage og tandmasse17.
Stamceller fra fedtvævet er lette at få adgang til, i modsætning til stamceller afledt af knoglemarv. Høstning af stamceller fra knoglemarv er en risikabel og smertefuld procedure sammenlignet med fedtsugning. Antallet af celler, der er mulige at høste fra knoglemarv, vil være begrænset, mens kun patientens depoter af fedtvæv sætter grænsen for antallet af celler, der kan høstes. Det er derfor muligt at isolere en stor mængde stamceller fra fedtvævet uden efterfølgende behov for at dyrke cellerne for at opnå en tilfredsstillende mængde. De fedtafledte regenerative celler, også ofte omtalt som den stromale vaskulære fraktion (SFV), består af mange celletyper, herunder MSC’er, endotelceller, pericytter, immunceller og forfædre heraf18. Disse kan alle spille en rolle i den regenerative proces.
Formålet med denne undersøgelse er at undersøge stamcellernes virkning på ED efter RP ved at anvende 4 ml autologe ADRC’er isoleret fra friskhøstet fedtvæv efter injektion i corpora cavernosum.
Den præsenterede procedure for isolering af ADRC’er er ikke begrænset til kun at blive anvendt til ED-terapi, men kan anvendes i flere andre former for behandling og eksperimenter. Vores forsøg viste, at autologe, friskisolerede ADRC’er er sikre at bruge, og behandlingen er godt tolerabel i en 12 måneders opfølgning.
Før proceduren anvendes, er der nogle overvejelser, der skal foretages. En ulempe ved denne procedure er, at patienten skal være under generel anæstesi under fedtsugningen. Fedtsugning er mulig at udføre under lokalbedøvelse, men et tidligere forsøg har vist, at en kombination af lokalbedøvelsesmidler og adrenalin kan have en negativ indvirkning på cellevæksten af fibroblaster20. Risikoen for at være under generel anæstesi er generelt lav, men et negativt resultat ses stadig. Denne risiko skal tages i betragtning, når patienter udvælges til behandlingen. Fedtsugning er en kirurgisk procedure og vil derfor altid medføre risiko for komplikationer. Som med alle andre kirurgiske procedurer er der risiko for postoperativ blødning, der resulterer i dannelse af hæmatomer og risiko for infektion. Nogle af vores patienter rapporterede også en forbigående nedsat følsomhed i mavehuden. En øjeblikkelig komplikation til fedtsugning er blødning. Det er kendt, at patienter risikerer at få systemiske komplikationer, når store mængder væv fjernes. Fedtsugningen i denne procedure var relativt lille og betragtes derfor ikke som en risikofaktor.
Komplikationer til injektion af celler rapporteres som forbigående rødme, ømhed og hæmatomer.
Den enhed, der anvendes til isolering af ADRC’erne, blev valgt, fordi systemet er CE-godkendt. I Danmark er det obligatorisk at anvende CE-godkendt udstyr, fordi myndighederne kategoriserer behandling med stamceller som et lægemiddeltestforsøg, når ADRC anvendes til injektion i mennesker.
Enheden har fordele, såsom at hele proceduren standardiseres og udføres i et lukket sterilt miljø uden at kræve et højt klassificeret laboratorium. Risikoen for forurening reduceres derfor. Dette sikrer, at proceduren er ensartet og reproducerbar, og at slutproduktets kvalitet altid er den samme hver gang (det afhænger dog også af inputvævets kvalitet). Det er let at udføre isoleringen på enheden og kræver ikke specialuddannede operatører.
En begrænsning af enheden er, at den mindste indgang til maskinen er 100 g drænet lipoaspirat. Da fedtsugningen er helt færdig, før cellebehandlingen starter (og i vores tilfælde på et andet sted, ikke i OR) efter vores erfaring, vil dette kræve, at mængden af lipoaspirat er mindst 125 ml ved hjælp af det grove mål for 50 ml sprøjter. Ellers er der risiko for, at der ikke er nok materiale til, at maskinen kan gå videre med. Brug af den øvre endegrænse (maks. Input er 425 ml) ville også resultere i en meget lang isolationsprocedure.
Voksne stamceller fra både fedtvæv og knoglemarv synes at have kapacitet til selvfornyelse og differentiering som embryonale stamceller. En af fordelene ved ADRC’er i forhold til hæmopoietiske stamceller er et 100-500 gange højere udbytte pr. vævsvolumen sammenlignet med knoglemarv21,22, og derfor behøver ADRC’er ikke at blive dyrket. Desuden er hæmopoietiske stamceller vanskeligere og mere smertefulde at høste fra patienten end fedtvæv. I mange situationer er fedtvæv bare et affaldsprodukt efter operationen. Det er muligt at dyrke stamceller for at give et højere udbytte, der er egnet til angiogenese, men friskisolerede ADRC’er kan have højere angiogent potentiale end dyrket23.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er grundlagt af Odense Universitetshospital (11/31936), Center for Regenerativ Medicin (14/50427) og Kræftens Bekæmpelse.
Liposuction | |||
Abdominal Binder | Dale | Size depent of the patient | |
Adhessive OP-towel | Mölnlycke Health Care | 906677 | 90×75 cm |
Adrenalin 1 mg/ml | Amgros I/s | 74 44 23 | 1 ml |
Basic OP supplies | Mölnlycke Health Care | 97010873-07 | |
Carbon Steel blade 11 | Swann-Morton | ||
Chlorhixidine Ethanol | Faarborg Pharma | 5% colored | |
Disposable set Lipocollector 3 | Human Med | 670200 | |
Extension hoses | Extrudan | 5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long | |
Gaze Rags | Barrier | 175201 | 30×45 cm |
Jelonet | Smith and Nephew Medical Ltd | 90509225 | 10 x 10 cm |
Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram | Astra Zeneca | 20 mL | |
Mesorb Bandage | Mölnlycke Health Care | 677001 | 10×13 cm |
Microlance | Becton Dickinson | 304622 | 18 G + 23 G |
Monocryl suture | Ethicon | 04:00 | |
Ringer-lactat | Fresinus Kabi | ||
Sterile gloves | Gammex | 330052065 | |
Surgical Gown | Mölnlycke Health Care | 690103-01 | |
Surgical Marker | Richard-Allan | ||
Surgical Mask | 3M | ||
Syringe | Codan Medical | 6,28,402 | 50/60 ml cath tip |
Syringe | Becton Dickinson | 700016181 | 1 ml |
WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm | Human Med | REF 500001 | |
Isolation of ADRC's | |||
1 ml Syringe | Becton Dickinson | REF 303172 | |
3 way stopcock | One Med | REF 10554-01 | |
Adhesive OP-towel | Mölnlycke Health Care AB | REF 906677 | 90×75 cm |
Cytori Celution 800IV device | Cytori | ||
Desinfection swaps | Mediq Danmark | 3340010 | |
Microlance | Becton Dickinson | 25G (0,5*25 mm) | |
Nitril Gloves | Abena | Powder free | |
OR drape Sheet, 2 layers | Lohmann & Rauscher | REF 33005 | |
Ringers Lactate | Fresinus Kabi | 06756 (DK) | |
Sterile gloves | |||
Sterile gown | |||
Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise | Cytori | ||
Termometer | Thomas Scientific | traceable | |
Injection of ADRC's | |||
Aperture drape | One Med | REF1565-01 | 75*90 cm |
Desinfection swap | Mediq Danmark | 3340010 | |
Pean | Leibinger | 32-01257 | |
Silicone Vessel Loop | Purple Surgical | REF PS3203 | |
Sterile gloves | Sempermed | Or Use your favorite |