인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면
Summary
여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 > 1000 TFs 단일 실험에서.
Abstract
각 인간의 유전자를 조절 하는 전사 인자 (TFs)의 집합을 확인 하는 것은 수많은 실험과 전산 접근을 통합 발굴 작업입니다. 하나 이러한 방법은 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 결과, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트 합니다. 두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ‘ DNA-미끼 ‘ (예., 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ‘ TF-먹이,’ 취재 원 유전자 활성화에 대 한 상영 될 수 있는. Y1H 스크린을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 DNA 미끼 효 모 종자로 TF 먹이 라이브러리 또는 배열 변환 기반으로 합니다. 여기, 우리는 파이프라인 기술, 향상 된 Y1H 이라고 (eY1H) 분석 실험, TF DNA 상호 작용 고밀도 어레이 사용 하 여 TF 먹이 긴장의 기준점과 컬렉션으로 DNA 미끼 긴장 짝짓기에 의해 심문 하는 1536에서 심사를 허용 (HDA) 로봇 플랫폼 식민지 형식입니다. 이로써 처리량의 극적인 증가 (60 DNA 미끼 시퀀스에 대 한 > 1000 TFs 연구원 당 2 주 소요) 및 재현성. 우리는 스크린 및 그들을 해결 하는 방법 하는 동안 발생할 수 있는 문제의 예제로 서 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 인간의 발기인 시퀀스를 테스트 하 여 예상된 결과의 종류를 설명 합니다.
Introduction
생물 의학 분야에서 주요 문제는 각 인간의 유전자는 규제 메커니즘을 결정 하 고. 전사 유전자 식 수준을 제어 하는 첫 번째 단계 이며 고유한 각 유전자 녹음 방송 요인 (TFs)의 세트에 의해 통제 된다. 그 인 간에 대 한 인코딩 > 1500 TFs1,2, 각 유전자의 표현을 제어 하는 TFs의 완전 한 세트를 식별 오픈 도전 남아 있다.
두 가지 유형의 방법 TF DNA 상호 작용 지도를 사용할 수 있습니다: TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법3 (그림 1A). TF를 중심으로 방법에 관심의 TF genomic DNA 영역 또는 그것의 DNA 의무적인 특이성을 결정 하는 바인딩에 대 한 조사입니다. 이 방법은 높은 처리량 시퀀싱, 단백질 바인딩 microarrays 그리고 SELEX4,,56다음 chromatin immunoprecipitation (칩)를 포함 합니다. DNA 중심 방법에 관심사의 DNA 순서 DNA 시퀀스에 바인딩할 TFs의 세트를 결정 하기 위해 시험 되 다. 이러한 방법 중 가장 널리 적용 되는 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 실험, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자7,,89를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트.
두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ‘ DNA-미끼 ‘ (예를 들면, 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ‘ TF-먹이,’ 취재 원 유전자 활성화9,10 (그림 1B)에 상영 될 수 있는. DNA-미끼를 업스트림 복제 두 기자의 유전자 (LacZ HIS3)와 두 DNA bait::reporter 구조는 chromatinized ‘DNA-미끼 긴장’을 생성 하는 효 모 게놈으로 통합 TF-먹이, TF Gal4 TF, 효 모의 활성화 도메인 (AD) 융합을 표현 하는 플라스 미드에 인코딩된 TF DNA 상호 작용에 대 한 물고기 미끼 DNA 스트레인에 소개 된다. TF-먹이 미끼 DNA 시퀀스에 바인딩하는 경우 TF 먹이 광고 두 리포터 유전자의 활성화로 끌 것입니다. 결과적으로 긍정적인 상호 작용으로 세포 성장 판 히스티딘, 부족으로 극복 하 고 경쟁력 있는 억제제, 3-아미노-1,2,4-triazole (3-AT)에 대해 선택 하 고 X-여자의 블루 식민지로 시각 수 수 있습니다. 때문에 강력한 효 모 Gal4 광고 사용, Y1H 분석 transcriptional 활성 제 뿐만 아니라 repressors를 포함 하는 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 더하여, TF 먹이 강한 효 모 발기인 (ADH1)에서 표현, 그 상호 작용 수치가 낮은 생 식, 도전 칩11,12로 감지 하는 TFs에도 감지할 수 있습니다.
Y1H 분석 실험을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 다음 선택, 식민지, 및 상호 작용 TF를 식별 하는 시퀀스 또는 풀링된 TF 먹이 라이브러리를 변환 하 여 효 모 DNA 미끼 종자에 TF-먹이 도입 기반 개별 변형 복제8,9. 이들은 시간이 걸리는 프로토콜, 연구원 당 테스트할 수 있는 DNA 시퀀스의 수를 제한 합니다. Y1H 분석 실험, 이라는의 최근 개선 향상 Y1H (eY1H), 극적으로 각각 표현 하는 다른 효 모 종자의 컬렉션으로 효 모 DNA 미끼 종자 짝 고밀도 배열 (HDA) 로봇 플랫폼을 사용 하 여 심사 처리량을 증가 했다 TF-먹이10,13 (그림 1C). 이 화면만 세 접시를 사용 하 여 quadruplicate에서 가장 인간의 TFs를 테스트 수 있도록 1,536 식민지 형식을 사용 합니다. 또한, TF DNA 상호 작용 없음을 방식 테스트는이 이렇게 상호 작용 (예: 2 개의 noncoding 단일 뉴클레오티드 이체) DNA 미끼 및 다른 TFs 비교에 대 한 허용 또는 TF 변종11,12 ,14.
EY1H 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 구분 된 큰 인간, 꼬마 선 충 DNA를 중심으로 TF-DNA 상호 작용 네트워크 최신. 특히, 우리는 246 인간의 발달 강화 및 283 TFs12사이의 2230 상호 작용을 확인 했습니다. 또한, 우리 eY1H 분석 실험 변경된 TF 바인딩을 109 단일 뉴클레오티드 noncoding 변종 발달 기형, 암, 신경 질환 등 유전 질병와 관련 된 폭로를 고용 했다. 더 최근에, 사용 eY1H을 2576 C. 선 충 유전자 발기인 및 366 TFs11사이 21,714 상호 작용으로 구성 된 네트워크를 나타냅니다. 이 네트워크는 수십 선 충 C. TFs의 기능 역할을 밝히기 위해 쓸모 있었다.
DNA-미끼 얼룩을 생성 하 고 배경 기자 활동의 수준을 평가 프로토콜 되었습니다 다른15,,1617보고. 여기는 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 모든 인간 게놈 DNA 영역을 화면에 사용할 수 있는 eY1H 파이프라인에 설명 합니다. 효 모 DNA 미끼 변형 생성 되 고 TF 먹이 배열의 해당 접시에 발견, 일단 전체 프로토콜 2 주 (표 1)에서 수행할 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 프로토콜 단일 연구원 60 DNA 미끼 시퀀스를 동시에 화면 수 있도록 병렬화 할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하기 위해 우리는 CCL15와 IL17F 두 cytokine 유전자의 발기인 상영. 또한, 우리는 종류의 eY1H 분석 실험 및 그들을 해결 하는 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 문제를 설명 하기 위해 실패 한 화면에서 결과 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
로봇 eY1H 짝짓기 심사 방법은 크게 여기에 설명 된 이전 라이브러리 심사에 비해 관심의 기준점과 심사 방식 변화에 따라 DNA 영역에 바인딩되는 TFs의 집합을 식별 하려면 처리량을 증가 시킵니다. 또한, TF DNA 상호 작용 상호 작용의 90%가 감지 당 TF, 모든 4 개의 식민지에 대 한 긍정적인 테스트 및 상호 작용의 90%는 동일한 DNA 미끼 효 모 스트레인10 의 독립적인 화면에서 다시 테스…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회 [R35-GM128625 J.I.F.B.]에 의해 지원 되었다.
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Riferimenti
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