壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル
Summary
Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids は、人間の壊死性腸炎で見られるそれらと同類の炎症性変化を示しています。
Abstract
壊死性腸炎 (NEC) は、新生児の壊滅的な病気です。反発、障害、細胞死の増加は高められた腸の透磁率につながる人間の腸上皮の複数の病態生理学的変化によって特徴付けられます。NEC の多数の動物モデル、種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。さらに、疾患の病態やヒト、特に子供たちに直接新規の治療薬を研究する倫理的挑戦です。したがって、人間のティッシュを使用して NEC の新たなモデルを開発する非常に望ましいです。Enteroids は、腸管上皮細胞由来三次元 organoids です。彼らは、複雑な生理学的な相互作用、細胞シグナリング、およびホスト病原体の防御の研究に最適です。本稿で述べるプロトコルその文化人間 enteroids 腸切除を受けた患者からの腸管幹細胞の隔離の後。ひと腸管上皮のさまざまなセルの種類のネイティブへの分化を促す成長因子を含んでいる媒体で陰窩細胞を培養しています。これらの細胞は、細胞外の基底膜を模倣、足場として機能する蛋白質の合成、コラーゲン ミックスで栽培されています。その結果、enteroids は、頂基底極性を開発します。メディアのリポ多糖 (LPS) の共同管理は、enteroids、組織学的、遺伝的につながるとタンパク質発現変化人間 NEC で見られるそれらに類似の炎症反応を引き起こします。人間のティッシュを使用して NEC の実験モデルとして、この病気の治療法を識別する薬と治療の人間の試験の前にテストのためのより正確なプラットフォームがあります。
Introduction
人間 enteroids、ex vivo 3次元培養システム人間の腸組織サンプルの腸陰窩から分離された幹細胞から生成されます。この画期的モデル マウス1小腸の陰窩に Lgr5 幹細胞の発見に続く 2007 のハンス Clevers らの先駆者だった。自分の仕事は元の確立のための基礎を築いた重要な遺伝的または生理学的な変更2継代できる複数のセル型の vivo 腸管上皮文化。この発見以来 enteroids は、通常の消化生理学や再生医療2ホスト病原体の相互作用、炎症性腸疾患などの腸疾患の病態生理を研究する新たなモデルとして使用されています。
使用例として enteroids の消化管病態生理学の研究のための生体モデル代替技術いくつか利点があります。過去数十年の動物モデルと不死化腸癌由来細胞株は、腸の生理3,4,5を勉強する使用されています。単一細胞培養は、それにより細胞のクロストークとタンパク質発現、シグナル伝達、病原体による疾患6セグメント特異性に欠けている細胞の種類通常の腸の粘膜上皮に存在の多様性を表していません。Enteroids の幹細胞は、上皮細胞など上皮細胞、パネート細胞、杯細胞、enteroendocrine 細胞より3主要なに分化します。彼らは極性を展示、上皮の輸送機能を遂行し、腸管特異性6できます。Enteroids は、ひと腸管上皮の種類の細胞を要約することができます、のでこの認識された癌細胞ベースのシステムの制限を克服するためが。時間をかけて細胞の誘導体、subcloned と進化蛋白発現および局在3の大きい多様性を展示します。それどころか、enteroids は重要な遺伝的または生理学的な変更2継代することができます。NEC のための多数の動物モデルが存在する種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。これらの制限の結果として動物モデルから派生した治療は、時間の 90% を失敗する毒性または有効性3の違いによる人間の臨床試験でテストしたとき。複雑な消化管病態、したがってより多くのよりよい理解につながる Enteroids これらの欠陥を克服することが有望なの前臨床モデルとして成功し、コスト効果の高い治療技術革新。また、enteroid から生成される組織の時代は生物学的に重要な7最近の証拠があります。Enteroids は NEC の患者に生理学的な関連性を堅持、新生児の組織から生成されるので、これは我々 のモデルのための特に重要な詳細です。
ヒトの病気のモデルとして enteroids のユーティリティは展開し、重度と普及条件に治療法を見つけることを期待して続けます。壊死性腸炎 (NEC) は腸管壊死によって特徴付けられる新生児の壊滅的な腸疾患と腸の壁、敗血症、および死8の穿孔につながり。NEC の複雑で多因子性病態、原因、病気の正確なメカニズムはまだ解明されていない完全に;ただし、腸管透過性亢進は、明らかに病気プロセス8に関与しています。与え、NEC および潜在的な治療薬の研究は、特に子供たちは人間の倫理的挑戦的な人間の新生児のティッシュを使用して NEC の生物学的に関連する enteroid モデルを利用するため非常に重要です。これまで、enteroids では、NEC における限られた役割があります。このプロトコルでは、壊死性腸炎研究用生体モデル ex 小説として人間の腸組織サンプルから派生した enteroids の使用について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo ひと腸 enteroid モデルこの小説は、壊死性腸炎 (NEC) の腸粘膜バリアー障害の研究のための有用な方法として機能します。ここで紹介する enteroid 処理方法は、夫妻ミスティ良い、マイケル ・ Helmrath、ジェイソン ヴェルトハイムの10、11,12の前の仕事から合わせられました。
詳細全体を取り巻く組?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、糖尿病、消化器・腎臓病グラント (K08DK106450) C.J.H. にアメリカの小児外科協会からジェイ Grosfeld 賞の健康研究所の国立研究所によって支えられました。
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
Riferimenti
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