नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ के एक उपंयास मानव उपकला एंड्रोइड मॉडल
Summary
एंट्रल मानव रोग के अध्ययन में एक उपंयास मॉडल के रूप में उभर रहे हैं । प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि नवजात ऊतक से उत्पन्न आंत्रशोथ के लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के उपचार का उपयोग कर मानव नेक्रोटाइज़िंग एन्टीरोकोलाइटिस के एक एंटिरॉइड मॉडल का अनुकरण कैसे करें । एकत्र आंत्रशोथ मानव परिगलन enterocolitis में देखा उन के सदृश भड़काऊ परिवर्तन का प्रदर्शन ।
Abstract
नेक्रोटाइज़िंग एंटोरोकोलाइटिस (NEC) नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी बीमारी है । यह मानव आंत्र उपकला में कई pathophysiologic परिवर्तन की विशेषता है, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता के लिए अग्रणी, बिगड़ा पुनर्शोधन, और वृद्धि की कोशिका मौत. हालांकि एनईसी के कई पशु मॉडल हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इसके अलावा, यह नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों, विशेष रूप से बच्चों में रोग पैथोफाइशियोलॉजी या उपंयास चिकित्सकीय एजेंटों का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, यह उच्च एनईसी के एक उपंयास मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर विकसित वांछनीय है । आंत्र उपकला कोशिकाओं से व्युत्पन्न 3-आयामी ऑर्गेनाइड्स हैं । वे जटिल शारीरिक बातचीत, सेल सिग्नलिंग, और मेजबान रोगज़नक़ रक्षा के अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं । इस पांडुलिपि में हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि संस्कृतियों आंत्र लकीर के दौर से गुजर रोगियों से आंत्र स्टेम सेल अलग करने के बाद मानव enteroids । तहखाना कोशिकाओं के विकास कारकों है कि मानव आंत्र उपकला के विभिन्न प्रकार के कोशिका के मूल निवासी में भेदभाव को प्रोत्साहित युक्त मीडिया में सभ्य हैं । इन कोशिकाओं को एक कृत्रिम, प्रोटीन है कि एक पाड़ के रूप में सेवा, अतिरिक्त सेलुलर तहखाने झिल्ली नकल उतारना में बड़े हो रहे हैं । एक परिणाम के रूप में, एंटेरोइड का विकास-basolateral ध्रुवता । मीडिया में लिपोपोलिसैकेराइड (LPS) के सह प्रशासन enteroids में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनता है, histologic, आनुवंशिक करने के लिए अग्रणी, और प्रोटीन अभिव्यक्ति मानव परिषद में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह परिवर्तन । एनईसी के एक प्रायोगिक मॉडल मानव ऊतक का उपयोग कर दवा और उपचार मानव परीक्षण से पहले परीक्षण के लिए एक अधिक सटीक मंच प्रदान कर सकते हैं, के रूप में हम इस बीमारी के लिए एक इलाज की पहचान करने का प्रयास करते हैं ।
Introduction
मानव enteroids एक पूर्व vivo 3 आयामी संस्कृति मानव आंत्र ऊतक के नमूनों के आंत्र तहखाने से अलग स्टेम कोशिकाओं से उत्पंन प्रणाली हैं । इस जमीन को तोड़ने मॉडल हंस Clevers द्वारा बीड़ा उठाया था एट अल २००७ में Lgr5 की खोज के बाद +1चूहों में छोटी आंत के तहखाने में स्टेम सेल । उनके काम एक पूर्व vivo कई सेल प्रकार है कि महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged हो सकता है की आंतों उपकला संस्कृति की स्थापना के लिए नींव रखी । इस खोज के बाद से, enteroids सामान्य पाचन शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और पुनर्योजी दवा के रूप में आंत्र रोगों के pathophysiology2.
आंत्र पैथोफाइसियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में एंटरॉइड का उपयोग वैकल्पिक तकनीकों पर कई फायदे हैं । पिछले कई दशकों के लिए, पशु मॉडल और अमर आंतों के कैंसर-व्युत्पन्न कोशिका लाइनों आंत्र शरीर विज्ञान3,4,5का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कोशिका संस्कृतियों सामांय आंत्र उपकला में मौजूद कोशिका प्रकार की विविधता का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, जिससे सेल के पार करने के लिए सेल की कमी-टॉक और सेगमेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति में विशिष्टता, संकेतन, और रोगज़नक़ रोग प्रेरित6। आंत्रशोथ में स्टेम सेल एंटेरोसाइट्स, पैनेथ कोशिकाओं, गोबलेट कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं और अधिक3के रूप में प्रमुख उपकला कोशिका प्रकार में अंतर । वे ध्रुवता प्रदर्शन, उपकला परिवहन कार्य बाहर ले, और आंतों खंड विशिष्टता6के लिए अनुमति देते हैं । के बाद से enteroids मानव आंत्र उपकला के कई कोशिका प्रकार दोहराऊंगा कर सकते हैं, वे कैंसर सेल आधारित प्रणाली की इस मांयता प्राप्त सीमा पर काबू पाने में सक्षम हैं । समय के साथ, सेल लाइनों के डेरिवेटिव subcloned है और प्रोटीन अभिव्यक्ति और3स्थानीयकरण में अधिक से अधिक विविधता को प्रदर्शित करने के लिए विकसित । इसके विपरीत, enteroids महत्वपूर्ण आनुवंशिक या शारीरिक परिवर्तन2के बिना passaged किया जा सकता है । हालांकि एनईसी के लिए कई पशु मॉडल मौजूद हैं, चोट और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए प्रतिक्रिया प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है । इन सीमाओं का एक परिणाम के रूप में, पशु मॉडल से व्युत्पन्न चिकित्सा विज्ञान समय की ९०% असफल जब विषाक्तता या प्रभावकारिता में अंतर के कारण मानव परीक्षण में परीक्षण3. Enteroids पूर्व नैदानिक मॉडल है कि इन कमियों को दूर कर सकते है के रूप में सेवा, जटिल आंत्र pathophysiology की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी है और इसलिए, और अधिक सफल और लागत प्रभावी चिकित्सकीय नवाचारों । वहां भी हाल ही में सबूत है कि ऊतक की उंर है कि एक एंटिरॉइड से उत्पंन होता है biologically महत्वपूर्ण7। यह हमारे मॉडल के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विस्तार है क्योंकि enteroids नवजात ऊतक से उत्पन्न कर रहे हैं, जिससे NEC के साथ रोगियों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बनाए रखने.
मानव बीमारियों के मॉडल के रूप में enteroids की उपयोगिता के लिए गंभीर और व्यापक परिस्थितियों के इलाज खोजने की उंमीद में, विस्तार जारी है । परिगलन आंत्रशोथ (एनईसी) आंत्र परिगलन द्वारा विशेषता नवजात शिशुओं की एक विनाशकारी आंत्र रोग है और अक्सर आंत्र दीवार, गलाघोंटू के वेध की ओर जाता है, और8मौत । एनईसी के जटिल और मल्टीफैक्टोरियल पैथोफाइशियोलॉजी के कारण, रोग की सही व्यवस्था को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है; हालांकि, वृद्धि हुई आंतों पारगम्यता स्पष्ट रूप से रोग प्रक्रिया में फंसाया गया है8. यह देखते हुए कि एनईसी और संभावित चिकित्सीय एजेंटों के अध्ययन नैतिकता की दृष्टि से मानव विषयों में चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से बच्चों, यह उच्च एनईसी के एक जैविक रूप से प्रासंगिक एंटिरॉइड मॉडल का उपयोग मानव नवजात ऊतक का प्रयोग वांछनीय है । इस प्रकार अब तक, एनईसी के अध्ययन में एंटेरोइड की एक सीमित भूमिका है । यह प्रोटोकॉल एक उपंयास पूर्व vivo मॉडल के रूप में मानव आंत्र ऊतक के नमूनों से प्राप्त enteroids के उपयोग के लिए परिगलन enterocolitis के अध्ययन के लिए वर्णन करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस उपंयास पूर्व vivo मानव आंत्र एंड्रॉइड मॉडल परिगलन आंत्रशोथ (NEC) में आंत्र बाधा रोग के अध्ययन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है । यहां प्रस्तुत एंटरॉइड प्रोसेसिंग मेथड्स डीआरएस के पिछले काम ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान संस्थान द्वारा मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारी अनुदान (K08DK106450) और जे Grosfeld पुरस्कार अमेरिकी बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन से C.J.H. करने के लिए समर्थन किया गया था
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
Riferimenti
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