Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af en mus positionering enhed, der gør det muligt for passende placering af mus til intranasal administration af en hjerne-målretning peptid-siRNA formulering muliggør effektiv genhæmning i centralnervesystemet.
Intranasal (i) Drug levering til hjernen er dukket op som en lovende metode til at omgå blod-hjerne barrieren (BBB) for levering af lægemidler ind i centralnervesystemet (CNS). Nylige undersøgelser viser brugen af et peptid, RVG9R, indarbejde minimal receptor-binding domæne af rabies virus glycoprotein, i fremkalde leveringen af siRNA til neuroner i hjernen. I denne protokol leveres peptid-siRNA-formuleringen intranasalt med en pipette i den dominerende hånd, mens den bedøvede mus er fastholdt af Scruff med den ikke-dominerende hånd i en “hoved nedad-og-fremad position” for at undgå dræning i lungerne og mave ved indånding. Denne præcise gribende af mus kan læres, men er ikke let og kræver praksis og dygtighed til at resultere i effektiv CNS optagelse. Desuden er processen langtrukne, der kræver ca. 45 min for administration af et samlet volumen på ~ 20-30 μL opløsning i 1-2 μL dråbe volumen pr. inhalation, med 3-4 min hvileperioder mellem hver inhalation. Formålet med denne undersøgelse er at afsløre en mus positionering enhed, der muliggør passende placering af mus til effektiv i administrationen af peptid-siRNA formulering. Flere funktioner er indarbejdet i udformningen af enheden, såsom fire eller otte positionerings stole med justerbar højde og hældning for at begrænse bedøvede mus i hovedet ned-og-fremad position, hvilket muliggør nem visualisering af musene Nares og en indbygget varmepude til at opretholde musene krops temperaturer under proceduren. Vigtigere, evnen til at behandle fire eller otte mus samtidig med RVG9R-siRNA komplekser på denne måde muliggør undersøgelser på en meget hurtigere tidsskala, til afprøvning af en i terapeutisk siRNA tilgang. Afslutningsvis, denne enhed giver mulighed for passende og kontrolleret muse hoved positionering for i anvendelse af RVG9R-siRNA og andre terapeutiske molekyler, såsom nanopartikler eller antistoffer, for CNS-levering.
BBB forhindrer systemisk administrerede molekyler af > 400-600 da fra at trænge ind i hjernen, hvilket udgør en betydelig udfordring for leveringen af terapeutiske biomolekyler for sygdomme, der påvirker CNS og hjernen1. Direkte Drug levering til hjernen kan opnås ved Stereotaktisk injektion; Dette kræver imidlertid kirurgisk ekspertise og er meget begrænset i leveringen til områder proksimalt på injektionsstedet, hvilket gør det uegnet til rutinemæssig klinisk brug2. I levering til hjernen kan også resultere i direkte hjernen levering ved at omgå BBB, giver mulighed for direkte og hurtig overførsel af en række stoffer til hjernen3,4. Denne overførsel menes at ske ved transport mekanismer via olfaktoriske og trigeminus nerver, der forbinder nasal passage til hjernen, cerebrospinalvæsken, og lymfesystemet5. Som den direkte næse-til-hjerne rute ikke involverer perifere organer og væv, det væsentligt reducerer systemiske bivirkninger og forbedrer styrken. I administrationen er et lovende ikke-invasivt alternativ til både lokale og systemiske ruter for hjernen levering af terapeutiske midler og kan repræsentere en stærk tilgang til at bekæmpe neurologiske lidelser, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og hjernekræft, og er ved at blive udforsket i flere kliniske forsøg6,7,8.
Flere eksperimentelle faktorer, såsom volumen og metode til inokulation, samt formulering pH, stærkt påvirker Drug levering til CNS via næse-til-hjerne pathway9. I undersøgelser med mus, succesen af i lægemiddel levering stærkt afhænger af korrekt hoved positionering, som er afgørende for effektiv hjerne deposition og for at undgå narkotika dræning i det ydre miljø eller luftvejene. Især, størstedelen af gnaver undersøgelser ansætte en hoved-back position (supine) med en 70 °-90 ° Tilt for Drug levering til olfaktoriske epitel, selv om hoved positionering på 0 ° kan favorisere dræning i luftrøret9. I leveringen af lægemidler i mus, der er vågne resulterer i reduceret hjerne aflejring i forhold til enhver applikation i liggende stilling, mest på grund af videnskabsfolk ‘ manglende evne til at holde mus i den ønskede position i længere tid. Desuden resulterer den opadrettede position, der kræves af den anvendte hudgrebs metode til vågen mus, i lægemiddel aflejring overvejende i trigeminus nerve og olfaktoriske pære samt perifere organer, såsom nyrer og lunger, inden for 30 min. postinoculation10. Den mest hensigtsmæssige kropsstilling til levering af terapeutisk gennem olfaktoriske eller trigeminus nerver i større dyr såsom ikke-menneskelige primater i kliniske undersøgelser synes at være hovedet ned-og-fremad position (dvs. den såkaldte “bede til Mekka position “)11. Men, denne holdning er ikke blevet godt undersøgt i muse-model, og liggende position er mere udbredt i gnaver undersøgelser.
Tidligere har vi vist, at RVG9R, et peptid designet baseret på den minimale receptor binding domæne af rabies virus, viser tropisme til celler, der udtrykker nicotinsyre acetylcholin receptor under enheder som neuroner og makrofager og medierer intracellulær levering af siRNA ved en mekanisme, der involverer receptor engagement og midlertidig plasma membran udflytning på stedet for receptor Aggregation12,13. Det er vigtigt, at systemisk intravenøs administration af RVG9R-siRNA-komplekser muliggør transvaskulær levering af siRNA til CNS14. Den systemiske rute udvander imidlertid den mængde siRNA, der leveres til CNS, og de seneste data viser, at i administration af RVG9R: siRNA-komplekser til mus placeret i hovedet nedad-og-fremad-position fremkalder et bredt Spread Target-gen Knockdown i flere regioner i hjernen15. Det er vigtigt, at dette niveau af Knockdown blev opnået med så lidt som 13,5 μg siRNA administreret over en fire-dosis, 2 dages regime, mens IV-ruten kræver en ~ 5 gange højere dosis pr injektion for at opnå sammenlignelige Knockdown. Den eneste mangel i den tilgang er, at det er en besværlig procedure, der kræver brug af begge hænder under administrationen af opløsningen, mens hele tiden griber musene alternativt i hovedet ned-og-fremad og i afslappede positioner mellem hver inhalation i en betydelig lang behandlingsperiode (en 30-45 min procedure for effektiv optagelse af en ~ 20-30 μL volumen pr. mus). Brug af musen positionering enhed præsenteret her giver mulighed for korrekt placering af mus med lidt fysisk tvang til dyrene og det personale, der udfører protokollen, samt behandling af flere kohorter af mus inden for en rimelig tidsperiode, muliggøre en dybtgående undersøgelse om brug af siRNAs som en terapeutisk for West Nile encephalitis i mus på sene stadier af sygdommen15.
Vi har udviklet en mus positionering enhed til optimalt positionering mus til næse-til-hjerne levering af Therapeutics. Enheden er udstyret med forskellige funktionaliteter, der sikrer nem samtidig håndtering af dyr. Den er også udstyret med varmepuder til vedligeholdelse af dyrenes fysiologiske krops temperaturer under eksperimenter. De bedøvede mus kan opretholdes i hovedet ned-og-fremad position ved hjælp af specielt designede stole, med minimal ubehag for dyrene. Højden af positionerings Stolene kan justeres på en sådan måde, som det er bedst at visualisere dyre næsebor, mens administration af lægemidler.
I hjernen levering har flere iboende begrænsninger, herunder den lille overflade af næsebor (tillader maksimale mængder af 20-30 μL pr administration), nasal irritation, Epitelet skader, og begrænset absorption på tværs af nasal epitel18. I administrationen af lægemidler til mus placeret i liggende stilling har været anvendt til hjernens levering ved at droppe flydende stoffer i dyrenes alternative Nares via pipette eller polyurethan slange (24 G x 19 mm) tilsluttet mikroliter sprøjter19, 20. selv om brugen af slange systemer til at frigive stoffer i nærheden af olfaktoriske epitel er en potentielt egnet tilgang, det forårsager irritation eller nasal inflammation ved gentagen administration. Desuden begrænser den lille størrelse af næsehulen denne tilgang, især i mus, der kan overvindes ved at gentage, samt ved lægemiddel formuleringer, der fortsætter i næseslimhinden. En anden mulighed er i administrationen af Therapeutics til vågen mus10. Denne fremgangsmåde kræver dog kvalificerede procedurer for håndtering af dyr under inokulering. Desuden, det forårsager dyre stress og derfor ikke er ideel til sygdomsmodeller, især smitsomme sygdomsmodeller. Desuden kan inkonsistent dosering let skyldes narkotika dræning i lungerne eller maven på grund af ufuldkommen animalsk gribe. Den fremgangsmåde, der præsenteres her, giver forskerne mulighed for at overvinde disse tekniske barrierer. Hovedet nedad-og-fremad position reducerer muligheden for stof lækage fra næsen til lungerne, mens indånding, favoriserer direkte og selektiv siRNA levering til hjernen. Ved levering ved hjælp af musen positionering enhed kræver ikke nogen specialiseret teknik til håndtering eller griber dyrene under inokulation. Fire dyr ad gangen kan behandles i en periode på mindst 30-45 min. Proceduren kan skaleres op ved at medtage en ekstra fire-Chair bar, der giver mulighed for nem styring af op til otte mus i samme eksperimentelle session. Derfor kan en enkelt operatør efter denne metode inducere levering af lægemidler til hjernen hos store grupper af dyr i længere tid ad gangen.
Den anatomiske struktur i næsehulen påvirker kraftigt næse-til-hjerne-leveringen (som gennemgået af Merkus et al.11 og Ruigrok og de lange21). Det relative overfladeareal af næsehulen i mus er 15 gange større end for mennesker, og det relative overfladeareal af olfabrikkens epitel er 6 gange større. Selv om der er betydelige forskelle i anatomi af næsehulen hos mennesker til gnavere, der er ca 45 kliniske forsøg undervejs ved hjælp af i tilgang til behandling af flere hjernen lidelser (www.clinicaltrials.gov). Undersøgelsen præsenteres her indikerer, at når du bruger i levering af Therapeutics, forskerne bør overveje flere faktorer, såsom hovedposition, sovende, og ordentlig levering agenter.
Vi har vist en effektiv og specifik aflejring af fluorescently mærket siRNA til muse hjernen. Endvidere, det betydelige fald i SOD1 genekspression observeret efter i siRNA levering bekræftet funktionelle virkninger. Vi har tidligere vist konsekvent, at i administrationen af RVG9R-siRNA komplekser rettet mod West Nile virus (WNV) RNA udøver en stærk terapeutisk virkning på WNV encephalitis15. Især, næse-til-hjerne siRNA levering krævede en celle-målretning ligand (RVG) og en positivt ladet molekyle (9R) til komplekse siRNA. I mangel af disse elementer blev molekyler ryddet gennem det systemiske kredsløb og lymfe skibene 48 h efter behandling (figur 3a)15. Derfor har vi i den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet her, undersøgt peptid/siRNA lokalisering 48 h efter inokulation til billedet kun de niveauer, der bevares specifikt i hjernen. Denne fremgangsmåde kan let gennemføres for levering af andre molekyler, såsom proteiner, peptider, og nanopartikler, eller andre Therapeutics, til behandling af en række hjerne-relaterede lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Koreas sundhedsministerium & Welfare (HI17C1046) til S.K.L.
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |