Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon
Summary
Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.
Abstract
CA2 +-sinyal normal sperm hücre işlevi ve erkek üreme için gerekli. Benzer şekilde, acrosome tepki zona pelusida nüfuz ve yumurtayı döllemek için insan bir sperm hücresi yetenek için çok önemlidir. Bu nedenle büyük ilgi için onların etkisi Ca2 +bileşikleri (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) test etmek için-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon ya insan sperm hücre işlevi üzerinde olası olumsuz etkileri incelemek için veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için. Burada, iki orta-den geçerek deneyleri açıklanmıştır: 1) bir floresan tabanlı tahlil Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-insan sperm ve 2) bir görüntü sitometrik tahlil acrosome tepki insan sperm olarak değerlendirilmesi için sinyal. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için çok sayıda ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon. Ayrıca, deneyleri çok özel doz-yanıt eğrileri bireysel bileşiklerin oluşturmak, iki veya daha fazla bileşikler için potansiyel additivity/synergism belirlemek için ve eylem yoluyla rekabetçi inhibisyon farmakolojik modu çalışmaya kullanılabilir CatSper inhibitörleri ile deneyler.
Introduction
Burada açıklanan iki deneyleri amacı Ca2 +etkileri incelemektir-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm için gösterildiği gibi çeşitli yayınlar bunlar istihdam içinde birden çok bileşikleri deneyleri1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-sinyalizasyon ve acrosome tepki hayati normal insan sperm hücre işlevi ve erkek üreme vardır.
Bir insan sperm hücre genel yumurtayı döllemek için hedeftir. Başarıyla ve doğal olarak yumurtayı döllemek için sperm hücre fonksiyonları sıkıca sperm hücresi ile kadın üreme sistemi8,9yolculuk sırasında düzenlenmiş olması gerekir. Sperm hücresi işlevlerin çoğunu düzenlenmektedir intrasellüler Ca2 +-konsantrasyon [Ca2 +]10ben (örneğin, sperm hareketliliği, kemotaksis ve acrosome reaksiyon). Ayrıca, sperm hücresi yumurtayı dölleme yeteneğine işler, capacitation denilen bir olgunlaşma sürecini kısmen düzenlenmiş tarafından [Ca2 +]ben10‘ dur. CA2 +-ekstrüzyon Ca2 +-ATPaz pompalar11 korumak bir yaklaşık 20.000 kat Ca2 +-bir dinlenme [Ca2 +]ben 50-100 nm ile insan sperm hücre zarı üzerinde gradyan. CA2 + hücre zarı geçmeye izin verilip verilmediğini (örneğin, Ca2 +delikten-kanalları), Ca2 + bir büyükçe akını oluşur, sebebiyet veren [Ca2 +]benbir ayrıcalık. Ancak, sperm hücresi de intrasellüler Ca2 +taşır-Ca2 + serbest bırakabilirsiniz mağazaları ve bu nedenle, da vermek bir ayrıcalık yükselmesi [Ca2 +]ben12artış. İlginçtir, tüm kanal-aracılı Ca2 +-akın insan sperm hücrelerinde CatSper (kediiyonik kanal SpeRM), sadece sperm hücresi11‘ de gösterilen üzerinden gerçekleşmesi için defa bulunmuştur. İnsan sperm hücrelerinde CatSper endojen ligandlar progesteron ve prostaglandin ayrı ligand siteleri13,14,15, bağlama aracılığıyla bir hızlı Ca2 +için önde gelen harekete-akını içine sperm hücresi. İki ana kaynağı yumurta yakınındaki bu endojen ligandlar yüksek düzeyde sağlar. Progesteron16yüksek düzeyde içeren foliküler sıvı biridir. Foliküler sıvı olgun foliküller yumurta yumurtlama ve karışımları oviducts17içinde sıvı ile birlikte yayımlanır. Diğer ana yumurta surround ve progesteron ve prostaglandin yüksek düzeyde yayın kümülüs hücreleri kaynağıdır. Progesteron kaynaklı Ca2 +-akın sperm hücresi içinde yumurta9,18doğru kemotaksisi aracılık, sperm hareketliliği19,20 kontrol ve acrosome teşvik gösterilen reaksiyon21. Bu bireysel [Ca2 +]benuyarının harekete geçirilmesine karşılık-düzenlenmiş sperm fonksiyonları doğru sırada ve doğru zamanda8yumurta döllenme için önemlidir. Bu, bir suboptimal progesteron kaynaklı Ca2 +doğrultusunda-akın bulundu ilişkili olmak azaltılmış erkek üreme22,23,24,25,26 ,27,28,29 ve fonksiyonel CatSper erkek üreme26,30,31,32için, temel 33,34,35,36.
Sperm hücresi yumurtayı ulaştığı fertilizasyon oluştuğu için olaylar dizisi gerçekleşmesi gerekir: 1) sperm hücreleri çevreleyen kümülüs hücre katmanı nüfuz gerekir, 2) bağlamak için zona pelusida, 3) exocytose acrosomal içerik, sözde acrosome tepki 37, 4) zona pelusida ve 5 nüfuz) sigorta fertilizasyon38tamamlamak için yumurta membran ile. Bu adım adım gitmek ve yumurtayı döllemek muktedir, sperm hücresi ilk olarak sperm hücresi “decapacitating” faktörler39 içeren meni bırakın ve dişi sıvı yüzmek başlar capacitation11, geçmeleri gerekir üreme yolu düzeyi yüksek olan bikarbonat ve albümin37. Capacitation hyperactivation, hareketliliği ile kamçı ve acrosome tepki37dinç dayak şeklinde geçmesi mümkün sperm hücreleri oluşturur. Hyperactivated motilite zona pelusida40penetrasyon için gereklidir ve acrosome bu penetrasyon süreci41yardım çeşitli hydrolytic enzimler içerir. Ayrıca, acrosome reaksiyonu sperm hücresi yumurta ile sperm yumurta füzyon42için gerekli sperm yüzeyinde belirli zar proteinleri açarak eritme yeteneğine işler. Sonuç olarak, hyperactivation ve acrosome reaksiyon geçmesi yeteneği vardır ikisi de yumurta40,42başarılı gübreleme için gereklidir. Ne için fare sperm hücresi43,44,45görülmüştür aksine, acrosome olduğu gibi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida46için bağlayabilirsiniz. İnsan sperm hücreleri zona pelusida bağlı acrosome tepki zona pelusida41 nüfuz ve yumurta38ile fusion için gerekli olan belirli zar proteinleri ortaya çıkarmak için geçmesi gerekmektedir. Zamanlaması acrosome tepki olarak insan sperm böylece fertilizasyon oluştuğu önemlidir.
CA2 +yukarıda açıklandığı gibi-sinyal hayati için normal sperm hücre işlevi8ve bu nedenle, bileşenleri, Ca2 +etkileri için çok sayıda ekran için büyük ilgi olduğunu-insan sperm hücreleri sinyal. Doğru zaman ve yerde acrosome tepki tabi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida nüfuz ve yumurta46,47döllemek benzer şekilde, aynı zamanda bileşiklerin onların yetenek-e doğru için test edebilmek için büyük ilgi olduğu insan sperm acrosome tepki etkiler. Bu amaçla, iki orta-den geçerek tarama deneyleri açıklanmıştır: etkileri üzerinde Ca2 +1) bir tahlil-insan sperm hücreleri ve 2) bir tahlil acrosome tepki insan sperm hücrelerinde ikna yeteneği için sinyal.
Tahlil 1 olduğunu orta-den geçerek Ca2 +-tahlil sinyal. Bu floresan plaka okuyucu tabanlı teknik Floresans zaman aynı anda birden fazla wells bir işlev olarak yapılan değişiklikleri izler. Ca2 +-hassas floresan boya, Fluo-4 Kd Ca2 +≈ 335 için vardır nM ve hücre-AM (acetoxymethyl) ester formunda permeant. Fluo-4 kullanarak, zamanla ve bileşikleri sperm hücresi ilgilendiren yanı sıra sonra [Ca2 +]i değişiklikleri ölçmek mümkündür. Tahlil Timo Strünker laboratuarda 201113 tarafından geliştirilen ve beri ekran bileşikler için çeşitli çalışmalarda etkisi Ca2 +için kullanılmıştır-insan sperm1,2,3‘ te, sinyal 4,5. Ayrıca benzer bir yöntem birden çok uyuşturucu adaylar48ekran kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu tahlil de farmakolojik modu eylem1,2,3,4,5, doz-yanıt eğrileri1değerlendirmek için yararlı olduğunu, 2,3,4,5, rekabetçi inhibisyon1,2, additivity1,2ve synergism3 bileşikler ilgi.
Tahlil 2 Orta-den geçerek acrosome tepki tahlil olduğunu. Bu görüntü sitometresi tabanlı teknik uygun miktarını ölçer acrosome tepki sperm hücresi üç floresan boyalar kullanarak bir örnek: propidium iyodür (PI), FITC birleştiğinde lektin Pisum sativum (FITC-PSA) ve Höchst-33342. Tahlil bir benzer Akış Sitometresi tabanlı yönteminden Zoppino vd.49 tarafından değiştirildi ve kullanılmış içinde çeşitli çalışmalar6,7. Gelince Ca2 +-sinyal tahlil, bu acrosome tepki tahlil doz-yanıt eğrileri, inhibisyon, additivity ve synergism ilgi bileşiklerin değerlendirmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tahlil Floresans tek microwells üzerinden tedavinin temel sinyal orta üretilen iş Ca2 + yaklaşık 250.000 sperm hücreleri içeren. Yakalanan sinyal iyi tüm bireysel sperm hücrelerinden ortalama. Tahlil böylece sperm hücre [Ca2 +]ben özellikle neresinde hakkında bilgi kayma yok değişti, [Ca2 +]i bir değişiklik yer, ya da ne kadar türdeş olmayan yanıttır alır sperm hücrelerinin bir kısmı ne büyüklükte sağlar tek tek hücreleri arasında. Bu t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Timo Strünker laboratuvar laboratuarına onların kalır sırasında AR ve DLE gözetiminin kabul etmek istiyorum. Ayrıca, bizim meslektaşları bölümü büyüme ve üreme, Kopenhag Üniversitesi Hastanesi, Rigshospitalet kadar bu iki deneyleri ayarı ile onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser hibe yenilik Fonu Danimarka (grant numaraları 005-2010-3 ve 14-2013-4) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
| 1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
| 1,4 and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
| 12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
| 384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
| 15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
| A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
| Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
| CaCl2 | |||
| Centrifuge | |||
| Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
| FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
| Glucose anhydrous | |||
| HEPES | |||
| Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
| Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
| Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
| Incubator | |||
| KCl | |||
| KH2PO4 | |||
| Magnetic stirrer | |||
| MgSO4 | |||
| Na-Lactate | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
| Pipettes and piptting tips | |||
| propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
| Purified water | |||
| Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
| S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
| SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
| Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
| Vortexer |
Riferimenti
- Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
- Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
- Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
- Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
- Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
- Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
- Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , (2018).
- Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
- Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
- Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
- Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
- Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
- Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
- Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
- Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
- Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), 52-56 (2006).
- Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals – an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
- Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), 866-876 (2013).
- Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
- Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), 418-428 (2014).
- Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), 120-124 (1995).
- Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
- Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
- Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
- Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), 2737-2746 (2015).
- Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d’Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
- Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), 1661-1667 (1996).
- Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), 1023-1033 (2018).
- Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), 1812-1816 (2018).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
- Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
- Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
- Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
- Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
- Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
- Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
- Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
- Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), 759-778 (2011).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
- Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), 4471-4479 (2013).
- Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
- Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
- Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
- Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
- Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
- Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , 1-11 (2017).
- Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
- Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
- Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
- Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
