Étudier les Interactiens ARN de la protéine Kinase RNA-activé durant le Cycle cellulaire chez les mammifères
Summary
Nous présentons des approches expérimentales pour étudier RNA-Interactiens de bicaténaire RNA binding protéine kinase activée par RNA (PKR) durant le cycle cellulaire chez les mammifères, à l’aide de cellules HeLa. Cette méthode utilise le formaldéhyde pour crosslink RNA-PKR complexes et immunoprécipitation pour enrichir PKR lié aux ARN. Ces ARN peut être davantage analysé par séquençage haut-débit ou qRT-PCR.
Abstract
Protéine kinase activée par RNA (PKR) est membre des réponse immunitaire innée de protéines et reconnaît la double-brin structure secondaire de l’ARN viral. Lorsqu’elle est liée à l’ARN double brin (dsRNA) viral, PKR subit une dimérisation et autophosphorylation ultérieure. PKR phosphorylée (pPKR) devenue active et induit la phosphorylation de la sous-unité alpha du facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2α) pour supprimer la traduction globale. Augmentant la preuve suggère que la PKR peut être activé dans des conditions physiologiques tels que durant le cycle cellulaire ou dans diverses conditions de stress sans infection. Cependant, nos connaissances sur les activateurs de RNA de PKR est limitée en raison de l’absence d’une méthode expérimentale normalisée pour capturer et analyser PKR-interaction ARN doubles brins. Nous présentons ici un expérimental protocole d’enrichir et de les analyser PKR spécifiquement lié RNAs durant le cycle cellulaire en utilisant des cellules HeLa. Nous utilisons l’activité efficace de réticulation du formaldéhyde pour fixer les complexes ARN-PKR et isoler par immunoprécipitation. PKR co-immunoprécipitée ARN peut ensuite être transformés pour générer une bibliothèque de séquençage haut-débit. Une classe importante de PKR-interaction cellulaire ARN doubles brins est ARN mitochondrial (mtRNAs), qui peut prendre la forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre le lourds-strand et la lumière-brin ARN. Afin d’étudier la présence de ces mtRNAs duplex, nous présentons également un protocole pour le volet spécifique qRT-PCR. Notre protocole est optimisé pour l’analyse de PKR lié aux ARN, mais il peut facilement être modifié afin d’étudier l’Arndb cellulaire ou RNA-Interactiens d’autres protéines de liaison des Arndb.
Introduction
Protéine kinase activée par RNA (PKR), kinase d’également connu sous le nom eucaryotes initiation factor 2-alpha 2 (EIF2AK2), est une kinase bien caractérisés qui transmet les informations fournies par les ARN. Il appartient à l’alpha de sous-unité d’initiation 2 traduction eucaryote (eIF2α) famille kinase et phosphoryle eIF2α à sérine 51 en réponse à l’infection pour supprimer la traduction globale1. Dans ce contexte, PKR est activé par l’ARN bicaténaire viral (ARN doubles brins), qui fournissent une plate-forme pour PKR dimérisation et autophosphorylation2. En plus d’eIF2α, PKR peut également phosphoryler p53, substrat de récepteur de l’insuline 1, inhibiteur κB et c-Jun N-terminal kinase (JNK) pour réguler l’activité de nombreux signal transduction pathways3,4,5, 6.
PKR a été initialement identifiée comme une kinase qui phosphorylé eIF2α au cours de l’infection par le poliovirus en reconnaissant ARN doubles brins7,8 des poliovirus. PKR se trouve de plus en plus à jouer un rôle aux multiples facettes au-delà de réponse immunitaire, et son activation aberrante ou le mauvais fonctionnement est impliqué dans nombreuses maladies humaines. Activé/Phosphorylated PKR (pPKR) est fréquemment observée au cours de l’apoptose et est une caractéristique commune des patients atteints de maladies dégénératives, en particulier les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer9 ,10,11,12,13. En outre, PKR est activé dans diverses conditions de stress tels que le stress métabolique et chaleur choc14,15,16,17. En revanche, l’inhibition de la PKR entraîne la prolifération cellulaire accrue et une transformation maligne même18,19. Fonction PKR est également importante dans le fonctionnement normal du cerveau et durant le cycle cellulaire comme le niveau de pPKR est élevée au cours de la phase de M20,21,22. Dans ce contexte, pPKR supprime la traduction globale et fournit des repères pour des systèmes de signalisation mitotiques clés qui sont nécessaires à la division cellulaire appropriée20. En outre, l’activation prolongée de PKR a entraîné en phase G2/M, arrêt du cycle cellulaire dans les ovaires de hamster chinois cellules23. Par conséquent, la phosphorylation de PKR est réglementée par la boucle de rétroaction négative afin d’assurer une désactivation rapide pendant M/G1 transition21.
Malgré la fonction du large éventail de PKR, notre compréhension de l’activation de PKR est limitée en raison de l’absence d’une approche expérimentale normalisée de haut-débit pour capturer et identifier les ARN doubles brins qui peut activer la PKR. Des études antérieures ont montré que la PKR peut interagir avec ARN doubles brins formé par deux inversée Alu répétitions (IRAlus)20,24, mais la possibilité de l’existence d’autres ARN doubles brins cellulaire qui peut activer la PKR durant le cycle cellulaire ou sous conditions de stress dans les cellules humaines était encore inexplorés. L’approche classique en identifiant RNA-Interactiens d’une protéine de liaison du RNA (RBP) utilise la lumière UV pour crosslink RNA-RBP complexes25,26,27. Une récente étude a appliqué cette approche de réticulation UV dans un système de souris et identifié que les petits ARN nucléolaires peut réguler activation de PKR lors de stress métabolique16. En utilisant la réticulation haute efficacité de formaldéhyde, nous avons présenté une méthode alternative pour identifier PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire de cellules HeLa28. Une approche similaire a été appliquée à l’étude des autres dsRBPs telles que Staufen et Drosha29,30,31. Nous avons trouvé que PKR peut interagir avec différents types d’ARN non codants tels que court interspersed nuclear élément (sinus), long intercalés nucléaire élément (ligne), élément de rétrovirus endogènes (ERV) et même alpha-satellite RNAs. En outre, nous avons montré que la PKR peut interagir avec ARN mitochondrial (mtRNAs), qui forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre les brins lourds et la lumière chapelet RNAs28. Une publication récente a aussi appuyé nos données que certains mtRNAs existent sous une forme recto verso et peut activer les capteurs de dsRNA comme protéine associée à la différenciation par mélanome 5 pour induire des interférons32. Plus important encore, l’expression et la localisation subcellulaire des mtRNAs sont modulés au cours du cycle cellulaire et de différents facteurs de stress, qui peut être important dans leur capacité à réguler la PKR activation28.
Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour une réticulation formaldéhyde récemment mis au point et l’immunoprécipitation (fCLIP) méthode pour capturer et analyser PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire. Nous démontrons la méthode pour préparer les échantillons d’arrestation cycle cellulaire à l’aide de la thymidine et la nocodazole. Puis, nous présentons le processus fCLIP pour isoler PKR lié aux ARN et une méthode pour préparer la bibliothèque de séquençage haut débit afin d’identifier ces ARN. En outre, nous définissent des procédures détaillées pour analyser PKR lié aux ARN par qRT-PCR. Plus précisément, nous présentons une procédure de transcription inverse brin spécifique pour analyser la présence de mtRNAs. Le protocole décrit est optimisé pour les cellules HeLa et PKR, mais des étapes clés tels que la préparation de l’échantillon du cycle cellulaire, fCLIP et analyse volet spécifique qRT-PCR peuvent être facilement modifiées pour étudier l’Arndb cellulaire ou d’identifier des Interactiens de RNA d’autres dsRBPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le processus de préparation d’échantillons de phase-arrêté S ou M est illustré à la Figure 1. Pour arrêter les cellules en phase S, nous avons utilisé une méthode de double bloc de thymidine où nous avons traité des cellules avec de la thymidine deux fois avec une sortie de 9 h entre les deux pour assurer l’arrestation haute efficacité (Figure 1 a). Arrestation de phase M, nous avons traité les cellules une fois avec de la thymidine suivie d’u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la base Science Research Program grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen, ministère de la Science et de la TIC (fro-2016R1C1B2009886).
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Riferimenti
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