공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터
Summary
우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.
Abstract
단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.
Introduction
단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.
PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.
PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.
이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B</strong…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Riferimenti
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