Patient afledte Ortotopiske xenograft-modeller til humant Urothelialt celle karcinom og kolorektal cancer tumor vækst og spontan metastase
Summary
Denne protokol beskriver genereringen af patient afledte ortotopiske xenograft-modeller ved intra-vesielt at indgyde højkvalitets urotheliale celle karcinom celler eller intra-rektalt injektion af kolorektal cancerceller i ikke-overvægtige diabetiske/svære kombinerede immundefekt (NOD/SCID) mus til primær tumorvækst og spontane metastaser under påvirkning af lymfeknude stromale celler, som efterligner progression af humane metastatiske sygdomme.
Abstract
Cancer patienter har dårlige prognoser, når lymfeknude (LN) involvering er til stede i både høj-grade urotheliale celle karcinom (HG-UCC) af blæren og kolorektal cancer (CRC). Mere end 50% af patienter med muskel-invasiv UCC, trods helbredende terapi for klinisk lokaliseret sygdom, vil udvikle metastaser og dø inden for 5 år, og metastatisk CRC er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA. Xenograft-modeller, der konsekvent efterligner UCC og CRC metastase set hos patienter, er nødvendige. Denne undersøgelse har til formål at generere patient-afledte ortotopisk xenograft (pdox) modeller af UCC og CRC for primær tumorvækst og spontane metastaser under påvirkning af LN stromale celler efterligne progression af humane metastatiske sygdomme for Drug screening. Frisk UCC og CRC tumorer blev opnået fra samtykkede patienter, der gennemgår resektion for HG-UCC og kolorektal adenocarcinoma, hhv. Co-inokuleret med LN stromale celle (lnsc) analoge HK celler, luciferase-Tagged UCC-celler var intra-vesically (Ib) indpodet i kvindelige ikke-overvægtige diabetisk/svær kombineret immundefekt (NOD/scid) mus, og CRC-celler var intra-rectally (IR) injiceres i mandlige NOD/SCID mus. Tumor vækst og metastase blev overvåget ugentligt ved hjælp af bioluminescens Imaging (BLI). Ved offer, primære tumorer og mus organer blev høstet, vejet, og formalin-fastgjort for Hematoxylin og eosin og immun histokemi farvning. I vores unikke PDOX-modeller ligner xenograft-tumorer patientens præ-implantations tumorer. I nærværelse af HK celler har begge modeller høj tumor implantation satser målt ved BLI og tumor vægte, 83,3% for UCC og 96,9% for CRC, og høj Fjern organ metastaser satser (33,3% opdaget lever eller lungemetastaser for UCC og 53,1% for CRC). Desuden har begge modeller nul dødelighed fra proceduren. Vi har etableret unikke, reproducerbare PDOX modeller for human HG-UCC og CRC, som giver mulighed for tumordannelse, vækst, og metastase undersøgelser. Med disse modeller kan testning af nye terapeutiske lægemidler udføres effektivt og på en klinisk mimetisk måde.
Introduction
Det har vist sig, at lymfeknuder (LN) metastase er en dårlig prognose indikator i mange solide orgel maligniteter, herunder høj-grade urotheliale celle karcinom (UCC) af blæren og kolorektal cancer (CRC)1,2. Over halvdelen af patienterne med muskel-invasiv UCC (MIUCC), trods helbredende terapi for klinisk lokaliseret sygdom, vil udvikle metastaser og dø inden for 5 år. Metastatisk CRC er en af de førende årsager til kræft relateret død i USA.
En anslået 81.190 nye patienter og 17.240 kræftspecifikke dødsfald forventes at forekomme i 2018 i USA på grund af UCC af blæren3,4. Patienterne vil overvejende (70%) nuværende med ikke-muskel invasiv sygdom, 30% vil have MIUCC5. På trods af kurativ terapi (radikal cystektomi [RC] med eller uden systemisk kemoterapi) for klinisk lokaliseret sygdom, halvdelen af patienter med MIUCC af blæren vil stadig udvikle metastaser og dø inden for 5 år3. Involvering af lymfeknuder findes hos ca. 20% − 25% af de patienter, der har gennemgået RC6,7,8. Femårig overlevelsesrate i LN positive patienter er mindre end 35% selv efter RC, hvilket tyder på LN involvering som en afgørende negativ prædiktor for prognosen i UCC patienter.
Kolorektal cancer er den tredje mest almindelige kræft diagnosticeret i både mænd og kvinder i USA. Patientens resultater afhænger i høj grad af tumorkarakteristika og tumor mikromiljø, såsom dybden af invasion, LN involvering, og fjerntliggende organ metastaser. Selv om dødeligheden i CRC faldt i det sidste årti på grund af screening og effektive operationer, anslås det, at næsten 50% af CRC-patienter vil udvikle metastaser eller recidiverende sygdom9.
Små dyremodeller giver en hurtig, reproducerbar og modificerbare platform til at studere tumorprogression og forskellige metastatiske mønstre. Der er i øjeblikket ingen beskrevne xenograft-modeller, der konsekvent efterligner CRC og UCC metastase set hos patienter. Den primære vej af kræft fjerne metastase er via lymfatisk spredning. Ny forskning tyder på, at LNs giver tumorer med et unikt mikromiljø, og er ikke kun blot stationære mål, hvor kræftceller forbigående passere, men også spille en integreret rolle ved at interagere med kræftceller i den metastatiske proces. Faktisk, vores undersøgelser opdagede, at ud over at uddanne og fremme tumorprogression og metastaser, LN stromale mikromiljø er også ansvarlig for lægemiddelresistens i CRC10,11. Vores laboratorium har for nylig bekræftet de tumorigent effekter af LN stromale celler (lnscs) på CRC og uccs ved hjælp af patient-afledte ortotopisk xenograft (pdox) musemodeller12,13.
Udvikling af pdox-modeller udgør en vigtig platform for Translationel kræftforskning14,15. Ved at opretholde de vigtigste histologiske og genetiske karakteristika for deres donor tumor forbliver pdox-modellerne stabile på tværs af passager og gør gode platforme for Translationel kræftforskning12,15. PDOX-modeller anvendes til præklinisk Lægemiddelvurdering, identifikation af biomarkør og præklinisk evaluering af personaliserede medicin strategier, der gør det muligt at forudsige kliniske resultater. I øjeblikket er der ingen beskrevne xenograft modeller, der overvejer betydningen af LN involvering og er i stand til konsekvent at gengive primær tumor og fjern orgel metastase i CRC og UCC. I denne undersøgelse beskriver vi udviklingen af PDOX-modeller i NOD/SCID-mus med reproduktion af metastatiske CRC-og UCC-sygdomme med involvering af LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastatisk sygdom er ansvarlig for de fleste kræftpatient dødelighed. I præ-kliniske terapeutiske tests, det er afgørende at etablere musemodeller, der mest tæt emulere menneskelig tumorvækst med spontane fjernt organ metastaser. Ved hjælp af murine modeller med implanteret patient tumor afledte kræftceller (xenografts) giver mulighed for en bedre forståelse af tumor biologi og prædiktiv biomarkører samt afprøvning og forudsigelse af antineoplastiske effekter af Novel behandlingsformer18</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller og Shannon McChesney, som hjalp med at iværksætte disse undersøgelser for deres fremragende tekniske støtte. Forfatterne takker også Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar og Maria Latsis for assistance i samtykkende patienter og giver tumorprøver.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Riferimenti
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
