रोगी व्युत्पन्न ओर्थोटोपिक Xenograft मॉडल मानव यूरोथेलियल सेल कार्सिनोमा और कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमर विकास और सहज मेटास्टेसिस के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट मॉडल द्वारा इंट्रा-वेसिअल रूप से उच्च ग्रेड यूरोथेलियल सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं या अंतर-rectally इंजेक्शन कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में गैर-बेबी मधुमेह / इम्यूनोडेफिशियेंसी (एनओडी/एससीआईडी) चूहों प्राथमिक ट्यूमर के विकास और लिम्फ नोड स्ट्रॉमल कोशिकाओं के प्रभाव में सहज मेटास्टेसिस, जो मानव मेटास्टैटिक रोगों की प्रगति की नकल करता है।
Abstract
कैंसर रोगियों को गरीब prognoses है जब लिम्फ नोड (LN) भागीदारी मूत्राशय और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के दोनों उच्च ग्रेड urothelial सेल कार्सिनोमा (एचजी-यूसीसी) में मौजूद है। मांसपेशी इनवेसिव यूसीसी के साथ रोगियों के 50% से अधिक, चिकित्सकीय-स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा के बावजूद, मेटास्टेसिस का विकास होगा और 5 साल के भीतर मर जाएगा, और मेटास्टैटिक सीआरसी अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौतों का एक प्रमुख कारण है। रोगियों में देखा लगातार यूसीसी और सीआरसी मेटास्टेसिस की नकल करने वाले Xenograft मॉडल की आवश्यकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य प्राथमिक ट्यूमर विकास और एलएन स्ट्रॉमल कोशिकाओं के प्रभाव में सहज मेटास्टेसिस के लिए यूसीसी और सीआरसी के रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट (पीडीओएक्स) मॉडल को दवा स्क्रीनिंग के लिए मानव मेटास्टैटिक रोगों की प्रगति की नकल करना है। ताजा यूसीसी और सीआरसी ट्यूमर क्रमशः एचजी-यूसीसी और कोलोरेक्टल एडेनोकार्सीनोमा के लिए लकीर के दौर से गुजर रहे सहमति वाले रोगियों से प्राप्त किए गए थे। LN stromal सेल (LNSC) एनालॉग एचके कोशिकाओं के साथ सह-inoculated, luciferase-टैग्ड यूसीसी कोशिकाओं इंट्रा-वेसically थे (आईबी) महिला गैर-बेबी मधुमेह में पैदा / नर NOD/ ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस को बायोल्युमिनेंस इमेजिंग (बीआईएल) का उपयोग करके साप्ताहिक निगरानी की गई थी। बलिदान पर, प्राथमिक ट्यूमर और माउस अंगों काटा गया, तौला, और formalin Hematoxylin और Eosin और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के लिए तय. हमारे अद्वितीय PDOX मॉडल में, xenograft ट्यूमर रोगी पूर्व प्रत्यारोपण ट्यूमर के समान. एच के कोशिकाओं की उपस्थिति में, दोनों मॉडल उच्च ट्यूमर प्रत्यारोपण दर BLI और ट्यूमर वजन द्वारा मापा, यूसीसी के लिए 83.3% और सीआरसी के लिए 96.9%, और उच्च दूर अंग मेटास्टेसिस दर (33.3% का पता चला जिगर या यूसीसी के लिए फेफड़ों मेटास्टेसिस और सीआरसी के लिए 53.1%). इसके अलावा, दोनों मॉडल प्रक्रिया से शून्य मृत्यु दर है. हम मानव HG-UCC और सीआरसी, जो ट्यूमर गठन, विकास, और मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अद्वितीय, reproduible PDOX मॉडल की स्थापना की है। इन मॉडलों के साथ, उपन्यास चिकित्सीय दवाओं का परीक्षण कुशलतापूर्वक और एक नैदानिक-मिमेटिक तरीके से किया जा सकता है।
Introduction
यह दिखाया गया है कि लिम्फ नोड (LN) मेटास्टेसिस मूत्राशय और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी)1,2के उच्च ग्रेड यूरोथैलियल सेल कार्सिनोमा (यूसीसी) सहित कई ठोस अंग द्रोह में एक गरीब पूर्वानुमान सूचक है। मांसपेशियों में इनवेसिव यूसीसी (एमआईयूसीसी) के साथ रोगियों के आधे से अधिक, नैदानिक-स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा के बावजूद, मेटास्टेसिस विकसित होगा और 5 साल के भीतर मर जाएगा। मेटास्टैटिक सीआरसी अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौत का एक प्रमुख कारण है।
एक अनुमान के अनुसार 81,190 नए रोगियों और 17,240 कैंसर विशिष्ट मौतों के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में होने की संभावना है3,4मूत्राशय के यूसीसी के कारण . जबकि रोगियों को मुख्य रूप से होगा (70%) गैर-मांसपेशी इनवेसिव रोग के साथ मौजूद, 30% MIUCC5होगा . चिकित्सकीय स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा (मूल सिस्टेक्टॉमी [आरसी] के साथ या बिना प्रणालीगत रसायन चिकित्सा के बावजूद, मूत्राशय के एमआईयूसीसी वाले आधे रोगी अभी भी मेटास्टेसिस विकसित करेंगे और 5 साल के भीतर मर जाएंगे3. लिम्फ नोड भागीदारी लगभग 20% में पाया जाता है -25% रोगियों में आर सी6,7,8से गुजरना है . एलएन सकारात्मक रोगियों में पांच साल जीवित रहने की दर आर सी के बाद भी 35% से कम है, यूसीसी रोगियों में पूर्वानुमान के लिए एक महत्वपूर्ण नकारात्मक भविष्यवक्ता के रूप में एलएन भागीदारी का सुझाव।
कोलोरेक्टल कैंसर तीसरे सबसे आम संयुक्त राज्य अमेरिका में दोनों पुरुषों और महिलाओं में निदान कैंसर है. रोगी परिणाम काफी हद तक ट्यूमर विशेषताओं और ट्यूमर microenvironment पर निर्भर करते हैं, इस तरह के आक्रमण की गहराई के रूप में, LN भागीदारी, और दूर अंग metastases. हालांकि सीआरसी में मृत्यु दर स्क्रीनिंग और प्रभावी सर्जरी के कारण पिछले दशक में कमी आई है, यह अनुमान है कि सीआरसी रोगियों के लगभग 50% मेटास्टेसिस या आवर्तक रोग9का विकास होगा .
छोटे पशु मॉडल ट्यूमर प्रगति और विभिन्न metastatic पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एक त्वरित, reproduible, और संशोधित मंच प्रदान करते हैं। वर्तमान में कोई वर्णित xenograft मॉडल है कि लगातार सीआरसी और यूसीसी मेटास्टेसिस रोगियों में देखा नकल कर रहे हैं. कैंसर दूर मेटास्टेसिस का प्राथमिक मार्ग लसीका प्रसार के माध्यम से है। नए शोध से पता चलता है कि LNs एक अद्वितीय microenvironment के साथ ट्यूमर प्रदान करते हैं, और न केवल स्थिर लक्ष्य जहां कैंसर कोशिकाओं क्षणिक पास हैं, लेकिन यह भी metastatic प्रक्रिया में कैंसर की कोशिकाओं के साथ बातचीत से एक अभिन्न भूमिका निभाते हैं. दरअसल, हमारे अध्ययनों से पता चला है कि, शिक्षित करने और ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के अलावा, LN stromal microenvironment भी सीआरसी10,11में दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार है. हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में सीआरसी और यूसीसी पर एलएन स्ट्रॉमल कोशिकाओं (एलएनएससी) के ट्यूमरीजेनिक प्रभाव की पुष्टि की है जिसमें रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट (पीडीओएक्स) माउस मॉडल12,13का उपयोग किया गया है।
पीडीओएक्स मॉडल का विकास अनुवाद कैंसर अनुसंधान14,15के लिए एक महत्वपूर्ण मंच प्रदान करता है . उनके दाता ट्यूमर के प्रमुख हिस्टोलॉजिक और आनुवंशिक विशेषताओं को बनाए रखने के द्वारा , पीडीओएक्स मॉडल मार्ग भर में स्थिर रहते हैं और अनुवाद कैंसर अनुसंधान12,15के लिए अच्छा मंच बनाते हैं . PDOX मॉडल पूर्व नैदानिक दवा मूल्यांकन, biomarker पहचान, और नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी के लिए अनुमति व्यक्तिगत चिकित्सा रणनीतियों के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. वर्तमान में, वहाँ कोई वर्णन xenograft मॉडल है कि LN भागीदारी के महत्व पर विचार कर रहे हैं और लगातार प्राथमिक ट्यूमर और सीआरसी और यूसीसी में दूर अंग मेटास्टेसिस प्रजनन करने में सक्षम हैं. इस अध्ययन में, हम एनएनएससी भागीदारी के साथ मेटास्टैटिक सीआरसी और यूसीसी रोगों के प्रजनन के साथ NOD/SCID चूहों में PDOX मॉडल के विकास का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मेटास्टैटिक रोग अधिकांश कैंसर रोगी नश्वरता के लिए जिम्मेदार है। पूर्व नैदानिक चिकित्सीय परीक्षणों में, यह माउस मॉडल है कि सबसे बारीकी से सहज दूर अंग metastases के साथ मानव ट्यूमर के विकास का अनुकरण स्थापित ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ब्रायन Reuter, डेनिएल Bertoni, पीटर मिलर, और शान्नोन McChesney जो उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए इन अध्ययनों को आरंभ करने में मदद धन्यवाद. लेखकों ने भी हीथ ग्रीन Matrana, मार्गरेट Variano, सुनील तलवार, और मारिया Latsis रोगियों की सहमति और ट्यूमर नमूने प्रदान करने में सहायता के लिए धन्यवाद.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Riferimenti
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