Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea
Summary
Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l’influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.
Abstract
I pazienti oncologici hanno una prognosi scarsa quando il coinvolgimento dei linfonodi (LN) è presente sia nel carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (HG-UCC) della vescica e del cancro del colon-retto (CRC). Più del 50% dei pazienti con UCC invasivo muscolare, nonostante la terapia curativa per malattie clinicamente localizzate, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni, e il CRC metastatico è una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Sono necessari modelli Xenograft che imitano costantemente la metastasi di UCC e CRC osservati nei pazienti. Questo studio ha lo scopo di generare modelli di xenotrapianto ortotopico (DOX) derivati dal paziente di UCC e CRC per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l’influenza di cellule stromali LN che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane per lo screening farmacologico. I tumori freschi di UCC e CRC sono stati ottenuti da pazienti conacchiti sottoposti a resezione rispettivamente per HG-UCC e adenocarcinoma colorettale. Co-inoculate con cellule HK analogiche con cellule nt-lmusali LN (LNSC), cellule UCC con tag luciferasi sono state intra-veseticamente (IB) instillate in topi da parentedeficisi diabetici/gravi (NOD/SCID) inebiti inominati in obliamente (IR) topi maschi NOD/SCID. La crescita tumorale e la metastasi sono state monitorate settimanalmente utilizzando l’imaging della bioluminescenza (BLI). Dopo il sacrificio, i tumori primari e gli organi murini furono raccolti, pesati e fissati in formalina per l’ematossiae e l’eosina e la colorazione immunoistochimica. Nei nostri modelli PDOX unici, i tumori dello xenotrapianto assomigliano ai tumori preimpianto del paziente. In presenza di cellule HK, entrambi i modelli hanno alti tassi di impianto tumorale misurato da PESI BLI e tumorali, 83,3% per UCC e 96,9% per il CRC, e alti tassi di metastasi dell’organo distante (33,3% rilevato metastasi epatica o polmonare per UCC e 53,1% per CRC). Inoltre, entrambi i modelli hanno mortalità zero dalla procedura. Abbiamo stabilito modelli PDOX unici e riproducibili per gli studi umani HG-UCC e CRC, che consentono la formazione di tumori, la crescita e gli studi sulle metastasi. Con questi modelli, il test di nuovi farmaci terapeutici può essere eseguito in modo efficiente e clinicamente mimetico.
Introduction
È stato dimostrato che la metastasi dei linfonodi (LN) è un indicatore prognostico incattive in molte neoplasie dell’organo solido, tra cui il carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (UCC) della vescica e del cancro colorettale (CRC)1,2. Oltre la metà dei pazienti con UCC muscolo-invasivo (MIUCC), nonostante la terapia curativa per la malattia clinicamente localizzata, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni. Il CRC metastatico è una delle principali cause di morte legata al cancro negli Stati Uniti.
Si stima che 81.190 nuovi pazienti e 17.240 decessi specifici per il cancro si verifichino nel 2018 negli Stati Uniti a causa dell’UCC della vescica3,4. Mentre i pazienti saranno prevalentemente (70%) presente con malattia invasiva non muscolare, il 30% avrà MIUCC5. Nonostante la terapia curativa (cistectomia radicale [RC] con o senza chemioterapia sistemica) per la malattia localizzata clinicamente, la metà dei pazienti con MIUCC della vescica svilupperà ancora metastasi e morirà entro 5 anni3. Il coinvolgimento dei linfonodi si trova in circa il 20%-25% dei pazienti che hanno subito RC6,7,8. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni nei pazienti positivi a LN è inferiore al 35% anche dopo RC, suggerendo il coinvolgimento di LN come predittore negativo cruciale per la prognosi nei pazienti ucc.
Il cancro colorettale è il terzo cancro più comune diagnosticato sia negli uomini che nelle donne negli Stati Uniti. Gli esiti del paziente dipendono in gran parte dalle caratteristiche tumorali e dal microambiente tumorale, come la profondità di invasione, il coinvolgimento di LN e le metastasi di organi distanti. Anche se il tasso di mortalità nel CRC è diminuito nell’ultimo decennio a causa di screening e interventi chirurgici efficaci, si stima che quasi il 50% dei pazienti crC svilupperà metastasi o malattie ricorrenti9.
I piccoli modelli animali forniscono una piattaforma rapida, riproducibile e modificabile per studiare la progressione del tumore e diversi modelli metastatici. Attualmente non esistono modelli di xenotrapianto descritti che imitano costantemente la metastasi CRC e UCC osservata nei pazienti. La via primaria della metastasi a distanza di cancro è attraverso la diffusione linfatica. Una nuova ricerca suggerisce che le LN forniscono ai tumori un microambiente unico, e non sono solo bersagli fissi in cui le cellule tumorali passano transitoriamente, ma svolgono anche un ruolo fondamentale interagendo con le cellule tumorali nel processo metastatico. Infatti, i nostri studi hanno scoperto che, oltre a educare e promuovere la progressione e le metastasi del tumore, il microambiente stromale LN è anche responsabile della resistenza ai farmaci in CRC10,11. Il nostro laboratorio ha recentemente confermato gli effetti tumorigeni delle cellule stromali LN (LNSC) su CRC e UCC utilizzando modelli murini ortotopici (PDOX) derivati dal paziente12,13.
Lo sviluppo di modelli DoDOX fornisce un’importante piattaforma per la ricerca traslazionale sul cancro14,15. Mantenendo le principali caratteristiche istologiche e genetiche del tumore del donatore, i modelli PDOX rimangono stabili tra i passaggi e rendono buone piattaforme per la ricerca traslazionale sul cancro12,15. I modelli DODoX vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci, l’identificazione dei biomarcatori e la valutazione preclinica di strategie di medicina personalizzate che consentono la previsione degli esiti clinici. Attualmente, non esistono modelli di xenotrapianto descritti che considerino l’importanza del coinvolgimento di LN e siano in grado di riprodurre costantemente il tumore primario e la metastasi dell’organo distante nel CRC e nell’UCC. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di modelli PDOX in topi NOD/SCID con riproduzione di malattie metastatiche CRC e UCC con coinvolgimento LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La malattia metastatica è responsabile della maggior parte dei decessi dei pazienti affetti da cancro. Nei test terapeutici pre-clinici, è fondamentale stabilire modelli murini che emulano più da vicino la crescita del tumore umano con metastasi spontanee di organi distanti. L’utilizzo di modelli murini con cellule tumorali derivate dal tumore del paziente impiantato (xenografi) consente una migliore comprensione della biologia tumorale e dei biomarcatori predittivi, nonché test e previsioni degli effetti antineoplas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller e Shannon McChesney che hanno contribuito ad avviare questi studi per il loro eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar e Maria Latsis per l’assistenza nei pazienti consenzienti e nella fornitura di campioni di tumore.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Riferimenti
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