Пациент полученных ортотопические ксенотрансплантат Модели для человека Уротелиальной карциномы клеток и колоректального рака опухоли роста и спонтанного метастаза
Summary
Этот протокол описывает поколение пациентов полученных ортопедических ксенотрансплантатмоделей моделей внутри-vesically прививая высококачественные клетки уротелиальной клетки карциномы или внутриректично инъекционных колоректальных раковых клеток в нетупозированную диабетическую/ тяжелую комбинированную иммунодефицита (NOD/SCID) мышей для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под воздействием лимфатических узлов стромальных клеток, которые имитируют прогрессирование метастатических заболеваний человека.
Abstract
Онкологические больные имеют плохие прогнозы, когда лимфатический узла (LN) участие присутствует в обоих высококачественных уротелиальных клеток карциномы (HG-UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC). Более 50% пациентов с инвазивной мускулистой UCC, несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развиваться метастазаи и умирают в течение 5 лет, и метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США. Ксенотрансплантат модели, которые последовательно имитируют UCC и CRC метастазировать видели у пациентов необходимы. Это исследование направлено на создание пациента полученных ортотопических ксенотрансплантата (PDOX) модели UCC и CRC для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под влиянием Стромальных клеток ЛН имитирует прогрессирование человеческих метастатических заболеваний для скрининга наркотиков. Свежие опухоли UCC и CRC были получены от согласованных пациентов, проходящих резекцию для HG-UCC и колоректальной аденокарциномы, соответственно. Совместно с LN стромальной клетки (LNSC) аналоговые клетки HK, luciferase-tagged UCC клетки были внутри-vesically (IB) привили в женских не-ожирения диабетической / тяжелой комбинированной иммунодефицита (NOD / SCID) мышей, и КЛЕТКи CRC были внутриректированных (IR) вводили в мужские мышей NOD/SCID. Рост опухолей и метастазы отслеживались еженедельно с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI). При жертве, первичные опухоли и органы мыши были собраны, взвешены, и формалин-фиксированной для гематаксилина и эозина и иммуногистохимии окрашивания. В наших уникальных моделях PDOX опухоли ксенотрансплантата напоминают предимплантационные опухоли пациента. В присутствии hK-клеток обе модели имеют высокие показатели имплантации опухоли, измеряемые БЛИ и массами опухоли, 83,3% для UCC и 96,9% для CRC, а также высокие показатели метастазов органов (33,3% обнаруженных метастазов печени или легких для UCC и 53,1% для CRC). Кроме того, обе модели имеют нулевую смертность от этой процедуры. Мы создали уникальные, воспроизводимые модели PDOX для человека HG-UCC и CRC, которые позволяют для формирования опухоли, роста и метастазирования исследований. С помощью этих моделей тестирование новых терапевтических препаратов может быть выполнено эффективно и в клинически-миметической манере.
Introduction
Было показано, что метастазы лимфатических узлов (LN) является плохим прогностическом показателем во многих твердых злокачественных новообразований органов, в том числе высококачественной уротелиальной клеточной карциномы (UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC)1,2. Более половины пациентов с инвазивной мускулистой UCC (MIUCC), несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развивать метастазы и умирают в течение 5 лет. Метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США.
По оценкам, 81 190 новых пациентов и 17 240 случаев смерти от рака, как ожидается, произойдет в 2018 году в Соединенных Штатах из-за UCC мочевого пузыря3,4. В то время как пациенты будут преимущественно (70%) настоящее время с немышечными инвазивными заболеваниями, 30% будет иметь MIUCC5. Несмотря на лечебную терапию (радикальную цистэктомию с системной химиотерапией или без нее) при клинически локализованном заболевании,у половины пациентов с MIUCC мочевого пузыря все равно разовьется метастазы и они умирают в течение 5 лет 3. Участие лимфатических узлов встречается примерно у 20%-25% пациентов, перенесших RC6,7,8. Пятилетняя выживаемость у положительных пациентов СЛ составляет менее 35% даже после RC, что свидетельствует о том, что участие LN в качестве важнейшего отрицательного предиктора прогноза у пациентов СКК.
Колоректальный рак является третьим наиболее распространенным раком диагностируется у мужчин и женщин в Соединенных Штатах. Исходы пациентов в значительной степени зависят от характеристик опухоли и микроокружения опухоли, таких как глубина вторжения, участие LN, и отдаленные метастазы органа. Хотя смертность в CRC снизилась в последнее десятилетие из-за скрининга и эффективных операций, по оценкам, почти 50% пациентов CRC будет развиваться метастазаили или рецидивирующие заболевания9.
Малые модели животных обеспечивают оперативную, воспроизводимую и модифицируемую платформу для изучения прогрессирования опухоли и различных метастатических моделей. Есть в настоящее время не описанные модели ксенотрансплантата, которые последовательно имитируют CRC и Метастаз UCC видели у пациентов. Основной путь рака отдаленных метастаз через лимфатические распространения. Новые исследования показывают, что LNs обеспечивают опухоли с уникальной микросредой, и не только просто стационарные цели, где раковые клетки временно проходят, но и играют важную роль, взаимодействуя с раковыми клетками в метастатическом процессе. Действительно, наши исследования показали, что, в дополнение к обучению и содействию прогрессирования опухоли и метастазирования, LN стромальной микросреды также несет ответственность за лекарственную устойчивость в CRC10,11. Наша лаборатория недавно подтвердила опухолевые эффекты LN стромальных клеток (LNSCs) на CRC и UCCs с использованием пациента полученных ортотопический ксенотрансплантат (PDOX) модели мыши12,13.
Разработка моделей PDOX является важной платформой для трансляционных исследований рака14,15. Поддерживая основные гистологические и генетические характеристики их донорской опухоли, модели PDOX остаются стабильными через проходы и сделать хорошие платформы для трансляционных исследований рака12,15. Модели PDOX используются для доклинической оценки лекарственных средств, идентификации биомаркеров и доклинической оценки персонализированных стратегий медицины, позволяющих прогнозировать клинические исходы. В настоящее время нет описанных моделей ксенотрансплантата, которые учитывают важность участия LN и способны последовательно воспроизводить первичную опухоль и отдаленные метастазы органов в CRC и UCC. В этом исследовании мы описываем разработку моделей PDOX у мышей NOD/SCID с размножением метастатических заболеваний CRC и UCC с участием LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метастатическое заболевание является причиной большинства случаев смерти больных раком. В доклинических терапевтических тестах крайне важно установить модели мыши, которые наиболее точно эмулируют рост опухоли человека спонтанными дистанционными метастазами органов. Использовани…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Брайана Ройтера, Даниэль Бертони, Питера Миллера и Шеннона Маккесни, которые помогли начать эти исследования за отличную техническую поддержку. Авторы также благодарят Хизер Грин Матрана, Маргарет Вариано, Сунила Талвара и Марию Латис за помощь в согласовании пациентов и предоставлении опухолевых образцов.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Riferimenti
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
