Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von orthotopischen Xenograft-Modellen durch intravesische Instillation hochwertiger urotheliaaler Zellkarzinomzellen oder intrarekt injizierende Darmkrebszellen in nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID) Mäuse für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von Lymphknoten-Stromalzellen, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen imitieren.
Abstract
Krebspatienten haben schlechte Prognosen, wenn Lymphknoten (LN) Beteiligung sowohl in hochgradigen urotheliale Zellkarzinom (HG-UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC) vorhanden ist. Mehr als 50% der Patienten mit muskelinvasivem UCC werden trotz kurativer Therapie für klinisch lokalisierte Krankheiten metastasen und innerhalb von 5 Jahren sterben, und metastasierendes CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA. Xenograft-Modelle, die UCC- und CRC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren, werden benötigt. Diese Studie zielt darauf ab, patientenabgeleitete orthotopische Xenograft (PDOX)-Modelle von UCC und CRC für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von LN-Stromalzellen zu generieren, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen für das Arzneimittelscreening imitieren. Frische UCC- und CRC-Tumoren wurden von einvernehmlichen Patienten gewonnen, die sich einer Resektion für HG-UCC bzw. kolorektales Adenokarzinom unterziehen. Ko-inokuliert mit LN-Stromalzellen (LNSC) analogen HK-Zellen wurden luziferase-markierte UCC-Zellen intravesisch (IB) in weibliche nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID)-Mäuse eingeflößt, und CRC-Zellen wurden intrarektifal (IR) in nod/SCID-Mäusen. Tumorwachstum und Metastasen wurden wöchentlich mit Hilfe der Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) überwacht. Nach dem Opfer wurden Primärtumoren und Mausorgane geerntet, gewogen und formal für Hämatoxylin und Eosin und Immunhistochemie Färbung fixiert. In unseren einzigartigen PDOX-Modellen ähneln Xenograft-Tumoren Patienten-Präimplantationstumoren. In Gegenwart von HK-Zellen weisen beide Modelle hohe Tumorimplantationsraten auf, die mit BLI und Tumorgewichten gemessen werden, 83,3 % für UCC und 96,9 % für CRC und hohe Metastasenraten des entfernten Organs (33,3 % nachgewiesene Leber- oder Lungenmetastasierung für UCC und 53,1 % für CRC). Darüber hinaus haben beide Modelle null Sterblichkeit aus dem Verfahren. Wir haben einzigartige, reproduzierbare PDOX-Modelle für menschliche sHG-UCC und CRC etabliert, die Tumorbildung, Wachstum und Metastasierungsstudien ermöglichen. Mit diesen Modellen können Tests neuartiger therapeutischer Medikamente effizient und klinisch mimetisch durchgeführt werden.
Introduction
Es hat sich gezeigt, dass Lymphknoten (LN) Metastasierung ein schlechter prognostischer Indikator in vielen soliden Organ-Malignitäten ist, einschließlich hochgradiges urothelialer Zellkarzinom (UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC)1,2. Mehr als die Hälfte der Patienten mit muskelinvasivem UCC (MIUCC) wird trotz kurativer Therapie bei klinisch lokalisierten Erkrankungen Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben. Metastasierende CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA.
Schätzungsweise 81.190 neue Patienten und 17.240 krebsspezifische Todesfälle werden 2018 in den Vereinigten Staaten aufgrund von UCC der Blase3,4erwartet. Während die Patienten überwiegend (70%) bei nicht-muskelinvasiven Erkrankungen vorhanden sind, haben 30% MIUCC5. Trotz der kurativen Therapie (radikale Zystektomie [RC] mit oder ohne systemische Chemotherapie) bei klinisch lokalisierten Erkrankungen wird die Hälfte der Patienten mit MIUCC der Blase noch Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben3. Die Beteiligung von Lymphknoten findet sich bei ca. 20% bis 25% der Patienten, die RC6,7,8. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei LN-positiven Patienten liegt selbst nach RC unter 35 %, was auf eine Beteiligung der LN als entscheidenden negativen Prädiktor für die Prognose bei UCC-Patienten hindeutet.
Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebserkrankung bei Männern und Frauen in den Vereinigten Staaten. Die Patientenergebnisse hängen weitgehend von Tumoreigenschaften und Tumormikroumgebung ab, wie z. B. Invasionstiefe, LN-Beteiligung und entfernte Organmetastasen. Obwohl die Sterblichkeitsrate in CRC in den letzten zehn Jahren aufgrund von Screening und effektiven Operationen gesunken ist, wird geschätzt, dass fast 50% der CRC-Patienten Metastasen oder wiederkehrende Krankheiten entwickeln werden9.
Kleine Tiermodelle bieten eine schnelle, reproduzierbare und veränderbare Plattform, um die Tumorprogression und verschiedene metastasierende Muster zu untersuchen. Es gibt derzeit keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die CRC- und UCC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren. Der primäre Weg der krebsfernen Metastasierung ist über lymphatische Ausbreitung. Neue Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die LNs Tumoren eine einzigartige Mikroumgebung bieten und nicht nur nur stationäre Ziele sind, bei denen Krebszellen vorübergehend passieren, sondern auch eine integrale Rolle spielen, indem sie mit Krebszellen im metastasierenden Prozess interagieren. Tatsächlich haben unsere Studien herausgefunden, dass neben der Aufklärung und Förderung der Tumorprogression und Metastasen auch die stromale Mikroumgebung von LN für die Arzneimittelresistenz in SCR10,11verantwortlich ist. Unser Labor hat vor kurzem die tumorgene Wirkung von LN-Stromalzellen (LNSCs) auf CRC und UCCs mit patientenabgeleiteten orthotopischen Xenograft (PDOX) Mausmodellen12,13bestätigt.
Die Entwicklung von PDOX-Modellen bietet eine wichtige Plattform für die translationale Krebsforschung14,15. Durch die Aufrechterhaltung der wichtigsten histologischen und genetischen Eigenschaften ihres Spendertumors bleiben PDOX-Modelle über Passagen hinweg stabil und bilden gute Plattformen für die translationale Krebsforschung12,15. PDOX-Modelle werden für die präklinische Arzneimittelbewertung, Biomarker-Identifikation und präklinische Bewertung personalisierter Arzneimittelstrategien verwendet, die eine Vorhersage klinischer Ergebnisse ermöglichen. Derzeit gibt es keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die die Bedeutung der LN-Beteiligung berücksichtigen und in der Lage sind, primärtumor und entfernte Organmetastasen in CRC und UCC konsequent zu reproduzieren. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung von PDOX-Modellen bei NOD/SCID-Mäusen mit Reproduktion von metastasierenden CRC- und UCC-Erkrankungen unter Beteiligung von LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastasierende Erkrankungen sind für die meisten Krebspatientensterblichkeit verantwortlich. In präklinischen therapeutischen Tests ist es entscheidend, Mausmodelle zu etablieren, die das menschliche Tumorwachstum mit spontanen entfernten Organmetastasen am ehesten emulieren. Die Verwendung von murinen Modellen mit implantierten Patiententumor abgeleiteten Krebszellen (Xenografts) ermöglicht ein besseres Verständnis der Tumorbiologie und prädiktiver Biomarker sowie Tests und Vorhersagen antineoplastischer Wirkungen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller und Shannon McChesney, die bei der Initiierung dieser Studien für ihre hervorragende technische Unterstützung geholfen haben. Die Autoren danken auch Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar und Maria Latsis für die Unterstützung bei der Einwilligung von Patienten und der Bereitstellung von Tumorproben.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
Riferimenti
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