Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos
Summary
Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.
Abstract
Várias limitações de sistemas de cultura de células 2D têm despertou interesse em plataformas de análise e cultura de células 3D, o que seria melhor imitar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e imitar as funções de tecido in vivo. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o desenvolvimento de ambientes in vitro em 3D em que as células podem ser integradas em uma matriz extracelular bem definida (ECM) e um conjunto definido de biomoléculas solúveis ou matriciais associadas. No entanto, as barreiras tecnológicas limitaram seu uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Aqui, descrevemos um método para construir dispositivos simples para a cultura 3D e experimentação com células e organóides multicelulares em microambientes 3D com um gradiente quimioatractivo definido. Nós ilustramos o uso desta plataforma para a análise da resposta de pilhas epithelial e de organóides aos gradientes de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Os gradientes de EGF eram estáveis nos dispositivos por diversos dias que conduzem à formação dirigida da filial em organoids da mama. Essa análise permitiu concluir que a detecção coletiva de gradiente por grupos de células é mais sensível versus células individuais. Nós igualmente descrevemos o método da fabricação, que não exige facilidades do photolithography nem técnicas macias avançadas da litografia. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D no contexto da análise do desenvolvimento e dos Estados patológicos, incluindo o câncer.
Introduction
No ambiente fisiológico, as células são incorporadas em uma matriz extracelular (ECM) e expostas a uma infinidade de biomoléculas. As interações entre as células e o microambiente circundante regulam processos intracelulares controlando diversos fenótipos, incluindo migração, crescimento, diferenciação e sobrevida1,2. Muito tem sido aprendido sobre os comportamentos celulares em uma cultura de células 2D convencional. Entretanto, com o advento da imagem latente e da experimentação intravital com as pilhas encaixadas em hydrogels 3D, as diferenças importantes em comportamentos da pilha foram reconhecidas nas culturas 2D in vitro simplificadas contra o tecido 3D-como ambientes. Enquanto as células interagem com as fibras de ECM e sentem suas propriedades mecânicas dentro da matriz 3D, a rigidez do material do gel não é uma variável totalmente independente em um sistema in vitro 2D. A dimensionalidade altera a formação de adesão focal, resultando em diferentes morfologia e comportamento celular. Além disso, as células em uma superfície 2D são expostas a menos sinais de sinalização do que as células abertas a todas as direções em 3D.
Essas limitações aumentaram os interesses dos sistemas 3D que representam a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e melhor prever as funções in vivo do tecido. Eles foram desenvolvidos em muitas formas de organóides como microestruturas celulares de automontagem para células aleatoriamente intercaladas em ECM3,4. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o advento de vários tipos de sistemas de cultura 3D5,6,7, 8,9 para o estudo de alterações fenotípicas e respostas celulares a sinais solúveis; no entanto, as barreiras tecnológicas limitam o uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Em muitos casos, os processos de fabricação requerem técnicas de fotolitografia e conhecimentos de fundo para litografia suave. Além disso, vários fatores devem ser controlados para construir com sucesso um dispositivo e para conseguir uma função óptima do dispositivo durante um longo período de tempo.
Nosso método descreve como construir um dispositivo 3D PDMS para incorporar células e organóides multicelulares em um microambiente 3D com gradientes quimioatrativos definidos e, em seguida, analisar respostas epiteliais ao EGF10. Nossos dados revelam que a capacidade de organóides para responder a gradientes de EGF superficial surge do acoplamento químico intercelular através de junções de Gap. Sugere o potencial de organóides para a deteção mais precisa de entradas espacially graduadas fracas e ruidosas. O processo da fabricação não exige uma facilidade da sala de limpeza nem técnicas do photolithography. No entanto, o dispositivo 3D PDMS inclui os fatores necessários do ambiente fisiológico 3D. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D e tem grande potencial de pesquisa com diferentes tipos de células, quimioattractantes e combinações de ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fabricação de moldes PDMS foi realizada utilizando um serviço de impressão 3D comercial, mas também pode ser realizada por uma impressora 3D de alta-final em casa. Entre os vários métodos da fabricação 3D, o estereolitografia é recomendado para a geração de molde de alta resolução. Como a cura do PDMS ocorre em uma temperatura alta (80 ° c), os materiais devem ser suficientemente resistentes a termicamente, o que deve ser explicitamente especificado, se a impressão for terceirizada. Uma pós-cura térmi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios à AJE (NSF PD-11-7246, Fundação de pesquisa em câncer de mama (BCRF-17-048) e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
Riferimenti
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