الحمل الحراري تعزيز التسليم من ناقلات الفيروسية المرتبطة الغدينو البصريات إلى قشرة ريسوس Macaque تحت توجيه الصور بالرنين المغناطيسي على الانترنت
Summary
هنا، نقوم بإظهار الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من النواقل الفيروسية في القشرة كنهج فعال ومبسط لتحقيق التعبير البصري الجيني عبر المناطق القشرية الكبيرة في الدماغ macaque.
Abstract
في الجينات البصرية غير البشرية (NHP)، غالباً ما تكون إصابة المناطق القشرية الكبيرة بالنواقل الفيروسية مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، نبرهن على استخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من ناقلات الفيروسية البصرية في الحسية الجسدية الأولية (S1) والمحرك (M1) القشرية من المكاك للحصول على كفاءة، والتعبير القشرية على نطاق واسع من قنوات أيون حساسة للضوء. تم حقن ناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدينو (AAV) التي ترمز إلى أوبسين C1V1 المنصهر ة إلى بروتين فلوري أصفر (EYFP) في قشرة المكاك ريسوس تحت CED الموجهة بالرنين المغناطيسي. بعد ثلاثة أشهر من التسريب، أكد التصوير الفلورسنت مناطق كبيرة منالتعبير البصري (> 130 مم 2) في M1 و S1 في اثنين من المكاك. وعلاوة على ذلك، تمكنا من تسجيل استجابات موثوقة للفيزيولوجيا الكهربائية التي تثير الضوء من المناطق التي تعبر عن ذلك باستخدام صفائف الكورتيكوستيصور ية الدقيقة. في وقت لاحق التحليل النسيجي وتلطيخ المناعة ضد مراسل كشفت عن التعبير البصريات واسعة النطاق وكثيفة في M1 و S1 المقابلة للتوزيع المشار إليه من قبل التصوير الفلورسنت. هذه التقنية تمكننا من الحصول على التعبير عبر مناطق واسعة من القشرة في غضون فترة أقصر من الزمن مع الحد الأدنى من الضرر مقارنة مع التقنيات التقليدية ويمكن أن يكون النهج الأمثل للتسليم الفيروسي البصري في الحيوانات الكبيرة مثل NHPs. هذا النهج يدل على إمكانات كبيرة للتلاعب على مستوى الشبكة من الدوائر العصبية مع خصوصية من نوع الخلية في النماذج الحيوانية التطورية القريبة من البشر.
Introduction
علم الوراثة البصرية هو أداة قوية تسمح بالتلاعب في النشاط العصبي ودراسة اتصالات الشبكة في الدماغ. تنفيذ هذه التقنية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) لديه القدرة على تعزيز فهمنا للحساب العصبي على نطاق واسع, الإدراك, والسلوك في الدماغ الرئيسيات. على الرغم من أن علم الوراثة البصرية قد نفذت بنجاح في NHPs في السنوات الأخيرة1،2،3،4،5،6،7،وهو التحدي الذي يواجه الباحثون تحقيق مستويات عالية من التعبير عبر مناطق الدماغ الكبيرة في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم نهج فعال ومبسط لتحقيق مستويات عالية من التعبير البصري في جميع أنحاء مناطق واسعة من القشرة في المكاك. هذه التقنية لديها إمكانات كبيرة لتحسين الدراسات البصريات الحالية في هذه الحيوانات في تركيبة مع الدولة من بين الفن تسجيل8و9 والتحفيز البصري10 التكنولوجيات.
الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) هو وسيلة راسخة لتسليم العوامل الدوائية وغيرها من الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك ناقلات الفيروسية، إلى الجهاز العصبي المركزي11،12،13. في حين أن طرق التسليم التقليدية تنطوي على ضخ اتّصال منخفض الحجم متعدد موزع ة عبر مناطق صغيرة من الدماغ، يمكن أن يحقق CED توزيعًا أوسع وأكثر تكافؤًا للعوامل مع عدد أقل من التسريبات. تدفق السوائل السائبة الناجمة عن الضغط (الحمل الحراري) أثناء التسريب يسمح بنقل الأنسجة المستهدفة على نطاق أوسع وبشكل موحد عند تقديم ناقلات الفيروسية مع CED. في الدراسات الحديثة، أظهرنا الانتراب واللاحقة التعبير الجيني لمساحات كبيرة من المحرك الأولي (M1) والحسية الجسدية (S1) القشرية9 والمهاد14 باستخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة CED.
هنا، نحن الخطوط العريضة لاستخدام CED لتحقيق التعبير البصري الوراثي عبر المناطق القشرية الكبيرة مع عدد قليل فقط من الحقن القشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحدد تقنية مجدية وفعالة لتحقيق التعبير البصري على نطاق واسع في القشرة الحسية الجسدية والحركية الأولية NHP من قبل التصوير بالرنين المغناطيسي الموجه. استخدام الرنين المغناطيسي الموجه MR يقدم مزايا كبيرة على الأساليب التقليدية للتسريب الفيروسي في الدماغ NHP. وتتمثل إحدى هذه المزايا في ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه (AY)، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع (DARPA) إعادة التنظيم واللدونة لتسريع الانتعاش الإصابة (REPAIR; N66001-10-C-2010)، R01. NS073940، ومن قبل مركز التصوير في علم الأعصاب UCSF. كما تم دعم هذا العمل من قبل معهد يونيس كينيدي شيفير الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة رقم K12HD073945، ومركز واشنطن الوطني لبحوث الرئيسيات (WaNPCR، P51 OD010425)، و مركز تكنولوجيا الأعصاب (CNT، وهو مركز البحوث الهندسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت منحة EEC-1028725). نشكر كاميلو دياز بوتيا، تيم هانسون، فيكتور خرازيا، دانيال سيلفرسميث، كارين ج. ماكلويد، جوليانا ميلاني، وبليكلي أندروز على مساعدتهم في التجارب ونان تيان، جيوي هي، بيتر ليدوكوبيتش، ميشيل ماهاربيز، وتوني هاون على المساعدة التقنية.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Riferimenti
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
