Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea
Summary
Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.
Abstract
En la optogenética de primates no humanos (NHP), infectar grandes áreas corticales con vectores virales es a menudo una tarea difícil y que requiere mucho tiempo. Aquí, demostramos el uso de resonancia magnética (RM) convección guiada entrega mejorada (CED) de vectores virales optogenéticos en corticas primarias somatosensoriales (S1) y motor (M1) de macacos para obtener una expresión cortical eficiente y generalizada de canales ióniones sensibles a la luz. Los vectores virales asociados a adenos (AAV) que codifican las opsin C1V1 de desplazamiento rojo fusionadas a proteínafluorescentes amarillas (EYFP) se inyectaron en la corteza de macacos de resus bajo CED guiado por RMN. Tres meses después de la infusión, imágenes epifluorescentes confirmaron grandes regiones de expresión optogenética (>130 mm2) en M1 y S1 en dos macacos. Además, pudimos registrar respuestas electrofisiológicas fiables de las áreas de expresión mediante matrices microelectrocortigráficas. El análisis histológico posterior y la inmunomancha contra el reportero revelaron una expresión optogenética generalizada y densa en M1 y S1 correspondiente a la distribución indicada por imágenes epifluorescentes. Esta técnica nos permite obtener expresión en grandes áreas de la corteza en un período de tiempo más corto con un daño mínimo en comparación con las técnicas tradicionales y puede ser un enfoque óptimo para el parto viral optogenético en animales grandes como los NCP. Este enfoque demuestra un gran potencial para la manipulación a nivel de red de circuitos neuronales con especificidad de tipo celular en modelos animales evolutivamente cerca de los seres humanos.
Introduction
La optogenética es una potente herramienta que permite la manipulación de la actividad neuronal y el estudio de las conexiones de red en el cerebro. La implementación de esta técnica en primates no humanos (NCP) tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la computación neuronal a gran escala, la cognición y el comportamiento en el cerebro de los primates. Aunque la optogenética se ha implementado con éxito en los NCP en los últimos años1,2,3,4,5,6,7, un reto que los investigadores se enfrentan está alcanzando altos niveles de expresión en grandes áreas cerebrales en estos animales. Aquí, estamos proporcionando un enfoque eficiente y simplificado para lograr altos niveles de expresión optogenética en grandes áreas de la corteza en macacos. Esta técnica tiene un gran potencial para mejorar los estudios optogenéticos actuales en estos animales en combinación con la grabación de última generación8,9 y la estimulación óptica10 tecnologías.
La entrega mejorada por convección (CED) es un método establecido de entrega de agentes farmacológicos y otras moléculas grandes, incluidos los vectores virales, al sistema nervioso central11,12,13. Mientras que los métodos de administración convencionales implican múltiples infusiones de bajo volumen distribuidas en pequeñas regiones del cerebro, CED puede lograr una distribución más amplia y uniforme de los agentes con menos perfusiones. El flujo de fluido a granel (convección) impulsado por presión durante la perfusión permite una transducción distribuida más ampliamente y uniformemente del tejido objetivo al administrar vectores virales con CED. En estudios recientes, demostramos la transducción y posterior expresión optogenética de grandes áreas de masilla primaria (M1) y somatosensorial (S1) cortices9 y thalamus14 utilizando Resonancia magnética (MR) guiada por CED.
Aquí, delineamos el uso de CED para lograr la expresión optogenética en grandes áreas corticales con sólo unas pocas inyecciones corticales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, delineamos una técnica factible y eficiente para lograr la expresión optogenética a gran escala en la corteza primaria somatosensorial y motora de NHP por CED guiada por RMN. El uso de CED guiado por RMN presenta ventajas significativas sobre los métodos tradicionales de infusión viral en el cerebro NHP. Una de estas ventajas es la capacidad de lograr la expresión en grandes áreas con menos infusiones necesarias. Por ejemplo, con métodos convencionales, múltiples inyecciones de 1-2 l de la expresión de r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AY), la Reorganización de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y la Plasticidad para Acelerar la Recuperación de Lesiones (REPARACION; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, y por el Centro de Imágenes de Neurociencia UCSF. Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shiver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio K12HD073945, el Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington (WaNPCR, P51 OD010425), y el Centro de Neurotecnología (CNT, un Centro de Investigación de Ingeniería de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Díaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani y Blakely Andrews por su ayuda con los experimentos y Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz y Toni Haun por su ayuda técnica.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
Riferimenti
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