Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Summary

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Abstract

A gravação da único-fibra foi uma técnica eletrofisiológicos clássica e eficaz sobre as últimas décadas por causa de sua aplicação específica para fibras de nervo nos sistemas nervosos centrais e periféricos. Este método é particularmente aplicável aos gânglios da raiz dorsal (DRG), que são neurônios sensoriais primários que exibem uma estrutura pseudounipolar de processos nervosos. Os padrões e características dos potenciais de ação passados ao longo de axônios são graváveis nesses neurônios. O presente estudo utiliza gravações in vivo de fibra única para observar a falha de condução dos nervos ciáticos em ratos tratados com adjuvante completo de Freund (CFA). Porque o mecanismo subjacente não pode ser estudado usando gravações in vivo da único-fibra, remendo-grampo-gravações de neurônios de DRG são executados em preparações de DRG intact com o nervo ciático Unido. Estas gravações revelam uma correlação positiva entre a falha da condução e a inclinação de aumentação do potencial After-hyperpolarization (AHP) de neurônios de DRG em animais CFA-tratados. O protocolo para gravações in vivo de fibra única permite a classificação das fibras nervosas através da mensuração da velocidade de condução e monitorização das condições anormais nas fibras nervosas em determinadas doenças. DRG intact com nervo periférico Unido permite a observação da atividade de neurônios de DRG em a maioria de circunstâncias physiological. Conclusivamente, a gravação de fibra única combinada com a gravação eletrofisiológica de DRGs intactos é um método eficaz para examinar o papel da falha de condução durante o processo analgésico.

Introduction

A transmissão normal da informação ao longo das fibras nervosas garante a função normal do sistema nervoso. O funcionamento anormal do sistema nervoso também é refletido na transmissão do sinal elétrico de fibras nervosas. Por exemplo, o grau de desmielinização nas lesões de desmielinização central pode ser classificado através da comparação das alterações na velocidade de condução nervosa antes e após a aplicação da intervenção¹. É difícil de registrar as fibras nervosas intracellularmente, exceto em preparações especiais, como o AXON gigante de Lula². Portanto, a atividade eletrofisiológica só é gravável através do registro extracelular de fibras únicas. Como um dos métodos electrofisiológicos clássicos, a gravação da único-fibra tem uma história mais longa do que outras técnicas. No entanto, menos eletrofisiologistas agarrando este método apesar de sua extensa aplicação. Portanto, uma introdução detalhada do protocolo padrão para gravação de fibra única é necessária para sua aplicação apropriada.

Embora as várias técnicas da remendo-braçadeira dominem o estudo eletrofisiológicos moderno, a gravação da único-fibra ainda joga um papel insubstituível em registrar as atividades de fibras de nervo, especial fibras que transmitem a sensação periférica com seus corpo de células sensoriais localizado no gânglio da raiz dorsal (DRG). A vantagem de usar a gravação da único-fibra aqui é que a gravação in vivo da fibra fornece um tempo longo da observação com a capacidade para gravar respostas aos estímulos naturais em modelos pré-clínicos sem violação do ambiente intracelular^{3 ,} a ⁴.

Um número crescente de estudos nas duas últimas décadas examinou funções complexas ao longo das fibras nervosas⁵, e a falha de condução, que é definida como um estado de transmissão de impulso do nervo mal sucedido ao longo do axão, estava presente em muitos diferentes nervos periféricos^6,7. A presença de falha de condução em nossa investigação serviu como mecanismo intrínseco de autoinibição para a modulação da entrada nociceptiva persistente ao longo das fibras C⁸. Esta falha da condução foi atenuada significativamente condições de hiperalgesia^4,9. Portanto, direcionar os fatores envolvidos na falha de condução pode representar um novo tratamento para a dor neuropática. Para observar a falha de condução, o padrão de queima deve ser gravado e analisado com base em picos sequencialmente descarregados com base na gravação de fibra única.

Para compreender completamente o mecanismo da falha da condução, é necessário identificar as propriedades da transmissão do axônio, ou mais precisamente, as propriedades da membrana de neurônios de DRG, baseadas em suas propriedades anatômicas pseudounipolares. Muitos estudos prévios neste campo foram realizados em neurônios dissociados de DRG^{10,11, o}que pode não ser viável para a investigação da falha de condução devido a dois obstáculos. Em primeiro lugar, vários métodos mecânicos e químicos são usados no processo de dissociação para libertar neurônios DRG, o que pode resultar em células não saudáveis ou alterar o fenótipo/propriedades dos neurônios e confundir os achados. Em segundo, os nervos periféricos anexados são removidos basicamente, e os fenômenos da falha da condução não são observáveis nestas preparações. Conseqüentemente, uma preparação de neurônios intactos de DRG com um nervo Unido foi melhorada para evitar os obstáculos acima mencionados.

Protocol

O protocolo atual seguiu o guia para a política do serviço de saúde pública dos Estados Unidos sobre a assistência humanitária e o uso de animais de laboratório, e o Comitê de ética em experimentos com animais da quarta universidade militar de medicina aprovou o protocolo. 1. os animais Divida 24 ratos Sprague-Dawley (4-8 semanas de idade) em dois grupos. Produzir o modelo adjuvante completo de Freund (CFA) por injeção intraplantar de 100 μL de CFA em um grupo de 14 ratos…

Representative Results

O resultado do protocolo de gravação de fibra única depende da qualidade da dissecção da fibra. O animal para experimentos in vivo deve estar em uma boa situação para manter o tronco nervoso saudável para fácil dissecção (ver conselhos na seção de discussão). Um banho da aplicação da droga é necessário em muitos casos para a entrega da droga em fibras. A Figura 1 ilustra como o registro de fibra única in vivo foi operado (Figura 1a) e apresenta uma gravaç…

Discussion

Embora os estudos recentes alcangaram a imagem latente do cálcio de neurônios de DRG in vivo¹⁶, realizando a gravação in vivo da remendo-braçadeira dos nociceptores individuais de DRG permanecem extremamente desafiantes. Conseqüentemente, uma aproximação in vivo da único-fibra para o campo da dor é da importância de continuação. A gravação da único-fibra no protocolo atual permite a observação objetiva de fenômenos da falha da condução, e a combinação desta técnica com a pr…

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
			experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia