Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour établir les points de terminaison importants et les marqueurs proliérants des petites lésions intestinales et de l’hyperprolifération compensatoire utilisant un modèle de muqueuse chimiothérapie-induite. Nous démontrons la détection des cellules proliférantes utilisant un marqueur spécifique de cycle cellulaire et utilisant le petit poids intestinal, la profondeur de crypte, et la taille de villus comme points de terminaison.
Abstract
L’adaptation intestinale est le mécanisme compensatoire naturel qui se produit lorsque l’intestin est perdu en raison d’un traumatisme. Les réponses adaptatives, telles que la prolifération des cellules cryptiques et l’absorption accrue des nutriments, sont essentielles à la récupération, mais mal comprises. Il est essentiel de comprendre le mécanisme moléculaire qui sous-tend les réponses adaptatives pour faciliter l’identification des nutriments ou des médicaments afin d’améliorer l’adaptation. Différentes approches et modèles ont été décrits dans toute la littérature, mais une façon descriptive détaillée d’exécuter essentiellement les procédures est nécessaire pour obtenir des données reproductibles. Ici, nous décrivons une méthode pour estimer les points de terminaison importants et les marqueurs proliérants des petites lésions intestinales et de l’hyperprolifération compensatoire utilisant un modèle de muqueuse induite par la chimiothérapie chez la souris. Nous démontrons la détection des cellules proliférantes utilisant un marqueur spécifique de cycle cellulaire, aussi bien qu’utilisant le petit poids intestinal, la profondeur de crypte, et la taille de villus comme points de terminaison. Certaines des étapes critiques de la méthode décrite sont l’enlèvement et la pesée de l’intestin grêle et le système logiciel assez complexe suggéré pour la mesure de cette technique. Ces méthodes ont les avantages qu’elles ne prennent pas de temps, et qu’elles sont rentables et faciles à réaliser et à mesurer.
Introduction
L’adaptation intestinale est le mécanisme compensatoire naturel qui se produit lorsque l’intestin est perdu en raison de la maladie ou la chirurgie1,2. Après un traumatisme, l’intestin subit une réponse adaptative morphométrique et fonctionnelle, caractérisée par la prolifération des cellules de crypte et l’absorption accrue des nutriments3. Cette étape est essentielle dans la récupération, mais mal comprise. Les études expérimentales de la réponse adaptative intestinale se sont concentrées sur les changements se produisant après la petite résection d’entrailles chez les souris, les rats, et les porcs, mais comprenant le mécanisme moléculaire derrière la réponse adaptative dans d’autres genres de dommages (par exemple, chimique ou bactérienne) est crucial pour faciliter l’identification des nutriments ou des médicaments afin d’améliorer l’adaptation. Expérimentalement, différentes approches ont été employées pour décrire l’index moléculaire et cellulaire complexe de la petite pathologie intestinale, y compris la notation histopathologique et mesurant l’issue des dommages. Malgré cela, ce qui est absent de la littérature est une description détaillée de la façon d’effectuer les procédures qui sont nécessaires pour obtenir des données reproductibles. Lors de l’identification des facteurs impliqués dans l’adaptation, tels que les hormones intestinales, un modèle animal facile, à faible coût, et reproductible est justifiée et ici nous suggérons d’utiliser un modèle de muqueuse intestinale induite par la chimiothérapie (CIM).
L’un des critères d’évaluation les plus simples et les plus informatifs de la blessure et de l’adaptation est de mesurer la masse de l’intestin grêle (SI). Nous savons qu’une caractéristique de la muqueuse est l’apoptose des entéroocytes, l’atrophie de villus dépendante du temps et la mitose réduite. Par conséquent, l’examen de la morphologie intestinale est très pertinent dans les modèles précliniques4,5. Chez l’homme, une baisse de la citrulline plasmatique, un marqueur des entéroocytes fonctionnels, est en corrélation avec les scores de toxicité et les marqueurs inflammatoires6 en plus de la capacité absorptive7, suggérant que cet acide aminé est un excellent biomarqueur de Mucite. Citrulline peut être mesurée chez les souris et les rats, et a montré d’excellentes corrélations avec villus longueur8, survie crypte9, et la muqueuse induite par rayonnement10.
Un avantage majeur de la mesure de la citrulline plasmatique est la capacité de recueillir des mesures répétées d’un animal. Cependant, l’échantillonnage sanguin multiple chez la souris est limité à un volume sanguin total de 6 L/g/semaine et nécessite une anesthésie générale. Cela limite malheureusement également l’utilisation de mesures citrulline chez la souris. En outre, la mesure de la citrulline nécessite une chromatographie liquide de haute performance11,12, ce qui est coûteux et long. Récemment, nous avons montré que les niveaux de citrulline chez les souris sont en corrélation significative avec le poids de si (p lt; 0.001) (données non publiées), faisant de citrulline une mesure directe reflétant la masse d’entéroocytes. Une limitation à la mesure du poids SI est la nécessité pour les souris d’être sacrifiés et donc pas de mesures répétées dans la même souris sont possibles. Pourtant, la méthode offre la possibilité d’effectuer une variété d’autres analyses tissulaires dirigées vers la question de recherche, et ces faits peuvent vraisemblablement compenser l’utilisation supplémentaire des animaux. Nous suggérons donc d’utiliser le poids SI comme biomarqueur facile, peu coûteux et rapide des blessures et de l’adaptation chez la souris. Pour assurer la reproductibilité et la variation analytique acceptable, les intestins doivent être soigneusement enlevés de l’animal, rincés avec salin, vidés et séchés avant de peser. Dans cet article, nous montrons exactement comment cette procédure est effectuée.
Une autre caractéristique de la muqueuse est la perte des cellules proliférantes dans les cryptes et une hyperprolifération compensatoire au cours de la période régénérative3. Le marqueur cellulaire Ki67 a été fréquemment utilisé pour déterminer les cellules proliférantes rapides au moyen de l’immunohistochimie13. Même si Ki67 est un simple marqueur de prolifération, il a une tendance à l’imprécision car Ki67 est présent pendant toutes les phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2 et M)14. L’étiquetage spécifique est essentiel pour détecter les cellules réplitaires, c’est pourquoi nous suggérons l’incorporation in situ de 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU), un analogue synthétique de la thymidine, car il est largement limité aux cellules de reproduction dans la phase S15. BrdU est injecté dans les animaux 150 minutes avant le sacrifice et les cellules peuvent être ensuite détectées avec immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques BrdU. Dans cet article de méthode, nous montrons exactement comment mesurer la zone des cellules immunopositives de BrdU dans une crypte utilisant un logiciel libre d’image.
Les changements morphologiques et fonctionnels sont souvent étudiés dans des modèles de mucosite induits par 5-FU, où l’adaptation intestinale est évaluée par la hauteur de villus et la profondeur de crypte. Au cours de cette étude, nous avons constaté que pendant la phase aigue de la muqueuse, qui est égale à la phase de blessure, la prolifération mesurée par l’incorporation de BrdU n’est pas corrélée avec la profondeur de crypte. En revanche, la profondeur de crypte est significativement corrélée avec la prolifération vue dans la phase de réparation de la muqueuse, 3 à 5 jours après l’induction. Ceci suggère que la phase aigue de la muqueuse n’est pas mesurable par la profondeur de crypte seule. Nous suggérons que lors de l’utilisation de la prolifération comme point final dans la phase aigue des souris muqueuses, l’incorporation brdU devrait de préférence être utilisée, mais lors de la quanticité de l’hyperprolifération dans le stade ultérieur au cours de la phase de régénération, la profondeur de la crypte est un raisonnable alternative à l’incorporation de BrdU. L’objectif de cette étude était de décrire ce modèle d’une manière qu’il peut être utilisé par tous les chercheurs, à la fois dans le domaine de l’oncologie, mais surtout les chercheurs ne connaissent pas les modèles de blessures intestinales.
Le modèle décrit peut être utilisé pour phénotype modèles transgéniques en fonction de la réponse adaptative en utilisant le poids corporel, le poids SI et la profondeur de la crypte comme points de terminaison. Par exemple, nous montrons ici comment nous avons utilisé le modèle de la muqueuse induite par 5-fluorouracil (5-FU) dans un modèle cellulaire knock-out avec une sécrétion de cellules L insuffisante16. Le peptide-1 de Glucagon-like (GLP-1) et le peptide glucagon-like-2 (GLP-2) sont des hormones intestinales co-sécrétées des cellules L entéroendocrines en réponse à la prise de nourriture17,18. GLP-2 est reconnu comme un facteur important pour la guérison intestinale, la régulation de l’apoptose muqueuse et l’amélioration de la fonction barrière de la SI19,20,21,22. Basé sur la littérature, nous avons supposé que les hormones endogènes sont essentielles pour l’hyperprolifération compensatoire se produisant dans la réponse adaptative après des dommages.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons une méthode largement accessible pour étudier les blessures et la régénération si dans un modèle de souris. Il existe une grande variété de modèles animaux précliniques de lésions intestinales, mais il est essentiel que nous comprenions que chaque modèle est unique et que les critères d’évaluation doivent être appropriés pour répondre à la question de recherche. Ce modèle est excellent pour étudier la réponse adaptative aux blessures, mais les critères d’évaluation doivent êt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention sans restriction du Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research et de la Fondation Lundbeck.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
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