化学療法誘発性粘膜炎のマウスモデルを用いて小腸損傷と適応を評価するための重要なエンドポイントと増殖マーカー
Summary
ここでは、化学療法誘発性粘膜炎のモデルを用いて、小腸損傷および代償過剰増殖の重要なエンドポイントおよび増殖マーカーを確立するためのプロトコルを提示する。細胞周期特異的マーカーを用いて増殖細胞の検出を実証し、小腸重量、暗号深さ、およびウイルス高さをエンドポイントとして用いた。
Abstract
腸の適応は、外傷のために腸が失われたときに発生する自然な補償メカニズムです。クリプト細胞増殖や栄養吸収の増加などの適応応答は、回復に重要ですが、まだ十分に理解されていません。適応応答の背後にある分子メカニズムを理解することは、適応を高めるために栄養素や薬物の同定を容易にするために重要です。文献全体でさまざまなアプローチとモデルが説明されていますが、再現可能なデータを得るためには、本質的に手順を実行するための詳細な説明方法が必要です。ここでは、マウスにおける化学療法誘発性粘膜炎のモデルを用いて、小腸損傷および代償過剰増殖の重要なエンドポイントおよび増殖マーカーを推定する方法について説明する。細胞周期特異的マーカーを用いた増殖細胞の検出と、小腸重量、暗号深さ、およびウイルス高をエンドポイントとして用いる実証を行う。記載された方法内の重要なステップのいくつかは、小腸の除去と計量であり、この技術の測定のために提案されたかなり複雑なソフトウェアシステムである。これらの方法には、時間がかからず、費用対効果が高く、実行と測定が容易であるという利点があります。
Introduction
腸の適応は、病気や手術によって腸が失われたときに発生する自然な補償メカニズムです1,2.外傷の後、腸は形態的および機能的適応反応を受け、暗号細胞増殖および増加した栄養吸収3を特徴とする。この手順は、回復に重要ですが、十分に理解されていません。腸適応反応の実験的研究は、マウス、ラット、ブタの小腸切除後に起こる変化に焦点を当てているが、他の種類の傷害における適応反応の背後にある分子機構を理解する(例えば、化学的)または細菌)は、適応を高めるために栄養素や薬物の同定を容易にするために重要である。実験的に、組織病理学的スコアリングや傷害の結果の測定を含む、小腸病理学の複雑な分子および細胞指数を記述するために、異なるアプローチが使用されてきた。それにもかかわらず、文献に欠けているものは、再現可能なデータを得るために必要な手順を実行する方法の詳細な説明です。腸ホルモンなどの適応に関与する因子を特定する際には、簡単で低コストで再現可能な動物モデルが保証されており、ここでは化学療法誘発性腸粘膜炎(CIM)のモデルを使用することをお勧めします。
傷害および適応の両方の最も簡単で非常に有益なエンドポイントの1つは、小腸(SI)の質量を測定することです。粘膜炎の特徴は腸球のアポトーシス、時間依存性絨膜萎縮および減少した有人性症である。したがって、腸の形態を調べることは、前臨床モデル4、5において非常に関連性が高い。ヒトにおいて、機能する腸球のマーカーである血漿シトルリンの減少は、吸収能力7に加えて毒性スコアおよび炎症マーカー6と相関し、このアミノ酸が優れたバイオマーカーであることを示唆している。粘膜炎。シトルリンは、マウスとラットの両方で測定することができ、かつ、ニルス長さ8、暗号生存9、および放射線誘発粘膜炎10との優れた相関を示している。
血漿シトルリンを測定する主な利点は、1匹の動物から繰り返し測定を収集する能力です。しかし、マウスの複数の血液サンプリングは、6 μL/g/週の総血液量に制限され、全身麻酔を必要とする。これは残念ながら、マウスにおけるシトルリン測定の使用も制限する。さらに、シトルリンの測定には高性能液体クロマトグラフィー11、12が必要であり、コストと時間がかかる。最近,マウスのシトルリンレベルがSI重量(p< 0.001)(未発表データ)と有意に相関していることを示し,シトルリンは腸球塊を反映する直接測定を行った.SI重量の測定に制限は、マウスが犠牲にされる必要があるため、同じマウス内で繰り返し測定することは不可能です。それでもこの方法は、研究の質問に向けられた他の様々な組織分析を行う可能性を提供し、これらの事実は、おそらく動物の追加の使用を補うことができる。したがって、我々は、マウスにおける傷害および適応の容易で低コストで、速いバイオマーカーとしてSI重量を使用することをお勧めします。再現性と許容可能な分析変動を確保するために、腸は慎重に動物から除去し、生理生理生理で洗い流し、空にし、計量する前に乾燥する必要があります。この記事では、この手順の実行方法を正確に示します。
粘膜炎のもう一つの特徴は、再生期間中のクリプト内の増殖細胞の喪失と再生期間中の代償的過剰増殖3である。細胞マーカーKi67は、免疫組織化学13によって速増殖性細胞を決定するために頻繁に使用されている。Ki67は増殖の単純なマーカーであるが、細胞周期(G1、S、G2、およびM)14のすべての活性相中にKi67が存在するように不正確な傾向がある。特定の標識は複製細胞を検出するために不可欠であり、これは我々が5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)、チミジンの合成類似体のその代わりに組み込むことを提案する理由であり、それは主にS相15における細胞の複製に制限される。BrdUは犠牲の150分前に動物に注入され、その後BrdU特異的抗体を用いて免疫組織化学で細胞を検出することができる。この方法の記事では、自由な画像ソフトウェアを用いて暗号内のBrdU免疫陽性細胞の面積を測定する方法を正確に示す。
形態学的および機能的変化は、しばしば5-FU誘発粘膜炎モデルで研究され、腸の適応は、絨活度および暗号深さによって評価される。この研究の間に、傷害期に等しい粘膜炎の急性期の間に、BrdUの取り込みによって測定された増殖は暗号深さと相関しないことがわかった。これとは対照的に、暗号深さは、誘導後3~5日後の粘膜炎の修復段階で見られる増殖と有意に相関する。これは、粘膜炎の急性期は、暗号深さだけでは測定できないことを示唆している。粘膜炎マウスの急性期のエンドポイントとして増殖を使用する場合、BrdUの取り込みは好ましくは使用されるべきであるが、再生段階の後の段階で過増殖を定量する場合、暗号深さは合理的であるBrdUの設立に代わる。本研究の目的は、腫瘍学の分野で、特に腸の損傷モデルに精通していない研究者の両方で、すべての研究者が使用できる方法でこのモデルを記述することでした。
記載されたモデルは、体重、SI重量、暗号深度をエンドポイントとして使用する適応応答に従ってトランスジェニックモデルを表現するために使用できます。一例として、L細胞分泌が不十分な細胞ノックアウトモデルで5-フルオロウラシル(5-FU)誘導粘膜炎のモデルをどのように用いたのかを示す。グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)及びグルカゴン様ペプチド-2(GLP-2)は、食物摂取に応答して腸内分泌L細胞から共分される腸ホルモンである17,18である。GLP-2は、腸治癒の重要な因子として認識され、粘膜アポトーシスの調節およびSI 19、20、21、22のバリア機能の改善。文献に基づいて、我々は内因性ホルモンが傷害後の適応反応で起こる代償的過剰増殖に不可欠であると仮定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、マウスモデルにおけるSI損傷および再生を研究するための広くアクセス可能な方法を示す。腸損傷の多種多様な前臨床動物モデルが存在しますが、各モデルがユニークであり、エンドポイントが研究の質問に答えるのに適切でなければならないことを理解することが重要です。このモデルは、傷害に対する適応応答を研究するのに優れていますが、粘膜炎の前臨床モデルとしてモ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、基礎代謝研究のためのノボノルディスクセンターとルンドベック財団からの無制限の助成金によってサポートされました。
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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