Betydelig sluttpunkt og proliferativ markører å vurdere liten intestinal skaden og tilpasning benytter en musen modell av kjemoterapi-indusert mukositt
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å etablere viktige endepunkter og proliferativ markører for små tarm skader og kompenserende hyperproliferation ved hjelp av en modell av kjemoterapi-indusert mukositt. Vi viser påvisning av voksende celler ved hjelp av en celle syklus spesifikk markør og ved hjelp av små tarm vekt, krypten dybde og villus høyde som endepunkter.
Abstract
Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanismen som oppstår når tarmen er tapt på grunn av traumer. De adaptive responser, slik som krypten celle spredning og økt nærings absorpsjon, er avgjørende i utvinningen, men dårlig forstått. Forstå molekyl mekanismen bak adaptive svarene er avgjørende for å lette identifisering av næringsstoffer eller medikamenter for å forbedre tilpasningen. Ulike tilnærminger og modeller har blitt beskrevet gjennom hele litteraturen, men en detaljert beskrivende måte å i hovedsak utføre prosedyrene er nødvendig for å få reproduserbar data. Her beskriver vi en metode for å anslå viktige endepunkter og proliferativ markører for små tarm skader og kompenserende hyperproliferation ved hjelp av en modell av kjemoterapi-indusert mukositt i mus. Vi viser påvisning av voksende celler ved hjelp av en celle syklus spesifikk markør, samt bruk av små tarm vekt, krypten dybde og villus høyde som endepunkter. Noen av de kritiske skritt innenfor den beskrevne metoden er fjerning og veiing av tynntarmen og ganske komplekst programvaresystem foreslått for måling av denne teknikken. Disse metodene har fordelene at de ikke er tidkrevende, og at de er kostnadseffektive og enkle å gjennomføre og måle.
Introduction
Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme som oppstår når tarmen er tapt på grunn av sykdom eller kirurgi1,2. Etter traumer gjennomgår tarmen en morphometric og funksjonell adaptiv respons, karakterisert ved krypten celle spredning og økt nærings absorpsjon3. Dette trinnet er kritisk i utvinningen, men dårlig forstått. Eksperimentelle studier av intestinal adaptive responsen har fokusert på endringene som oppstår etter liten tarm reseksjon i mus, rotter og griser, men forstå den molekylære mekanismen bak adaptiv respons i andre typer skader (f. eks kjemiske eller bakteriell) er avgjørende for å lette identifisering av næringsstoffer eller medikamenter for å forbedre tilpasningen. Eksperimentelt, ulike tilnærminger har blitt brukt for å beskrive komplekse molekylær og cellulær indeks av liten intestinal patologi, inkludert histopathological scoring og måle utfallet av skaden. Til tross for dette, hva er fraværende fra litteraturen er en detaljert beskrivelse av hvordan du utfører prosedyrer som er nødvendig for å få reproduserbar data. Når identifisere faktorer involvert i tilpasning, for eksempel gut hormoner, en enkel, lav kostnad, og reproduserbar dyremodell er garantert, og her foreslår vi at du bruker en modell av kjemoterapi-indusert intestinal mukositt (CIM).
En av de enkleste og svært informative endepunktene på både skade og tilpasning er å måle massen av tynntarmen (SI). Vi vet at et kjennetegn på mukositt er apoptose av enterocytes, tidsavhengig villus atrofi og redusert mitose. Derfor undersøker intestinal morfologi er svært relevant i prekliniske modeller4,5. Hos mennesker, en nedgang i plasma citrulline, en markør for fungerende enterocytes, samsvarer med toksisitet score og inflammatoriske markører6 i tillegg til absorberende kapasitet7, antyder denne aminosyren er en utmerket biomarkør av mukositt. Citrulline kan måles i både mus og rotter, og har vist gode sammenhenger med villus lengde8, Crypt overlevelse9, og stråling-indusert mukositt10.
En stor fordel med å måle plasma citrulline er evnen til å samle gjentatte målinger fra ett dyr. Flere blodprøver hos mus er imidlertid begrenset til et totalt blod volum på 6 μL/g/uke og krever generell anestesi. Dette begrenser dessverre også bruken av citrulline målinger hos mus. Videre er måling av citrulline krever høy ytelse flytende kromatografi11,12, som er kostbart og tidkrevende. Nylig viste vi at citrulline nivåer hos mus samsvarer betydelig med SI-vekt (p < 0,001) (upubliserte data), noe som gjør citrulline til en direkte måling som reflekterer enterocyte masse. En begrensning til måling av SI-vekt er nødvendigheten av at musene skal bli ofret, og dermed er det ikke mulig med gjentatte målinger innenfor samme mus. Fortsatt metoden gir mulighet til å utføre en rekke andre vev analyser rettet mot forskningen spørsmålet, og disse fakta kan tenkes gjøre opp for ytterligere bruk av dyr. Vi foreslår derfor å bruke SI-vekt som en enkel, rimelig og rask biomarkør av skader og tilpasning hos mus. For å sikre reproduserbarhet og akseptabel analytisk variasjon, bør tarmen fjernes forsiktig fra dyret, spyles med saltvann, tømt og tørket før veiing. I denne artikkelen viser vi nøyaktig hvordan denne prosedyren utføres.
Et annet kjennetegn på mukositt er tapet av voksende celler i Krypter og en kompenserende hyperproliferation under regenererende periode3. Den cellulære markør Ki67 har blitt hyppig brukt til å bestemme rask proliferativ celler ved hjelp av immunhistokjemi13. Selv om Ki67 er en enkel markør for spredning, har den en tendens til upresisjonsverdier som Ki67 er til stede under alle aktive faser av cellesyklusen (G1, S, G2 og M)14. Spesifikk merking er viktig for å oppdage replikere celler, og det er derfor vi foreslår in situ innlemmelse av 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU), en syntetisk analog av tymidin, som det i stor grad er begrenset til å kopiere celler i S-Phase15. BrdU injiseres i dyrene 150 minutter før ofring og celler kan senere oppdages med immunhistokjemi bruker BrdU spesifikke antistoffer. I denne metoden artikkelen viser vi nøyaktig hvordan å måle arealet av BrdU immunopositive celler i en krypten ved hjelp av en gratis bildeprogramvare.
Morfologiske og funksjonelle endringer er ofte studert i 5-FU indusert mukositt modeller, der intestinal tilpasning er vurdert av villus høyde og krypten dybde. I løpet av denne studien, fant vi at i den akutte fasen av mukositt, som er lik skade fasen, spredning målt ved BrdU innlemmelse er ikke korrelert med krypten dybde. I motsetning til dette, er krypten dybde signifikant korrelert med spredning sett i reparasjons fasen av mukositt, 3 til 5 dager etter induksjon. Dette tyder på at den akutte fasen av mukositt ikke er målbar av krypten dybde alene. Vi foreslår at når du bruker spredning som et endepunkt i den akutte fasen av mukositt mus, bør BrdU innlemmelse fortrinnsvis brukes, men når kvantitere hyperproliferation i senere stadium i den regenererende fasen, er krypten dybde en rimelig alternativ til BrdU innlemmelse. Målet med denne studien var å beskrive denne modellen på en måte at den kan brukes av alle forskere, både innen onkologi, men spesielt forskerne ikke er kjent med intestinal skade modeller.
Den beskrevne modellen kan brukes til å fenotype transgene modeller i henhold til adaptiv respons ved hjelp av kroppsvekt, SI vekt og krypten dybde som endepunkter. Som et eksempel, viser vi her hvordan vi brukte modellen av 5-Fluorouracil (5-FU) indusert mukositt i en mobilnettet Knock Out modell med utilstrekkelig L-celle sekresjon16. Glukagon-som peptid-1 (GLP-1) og glukagon-lignende peptid-2 (GLP-2) er intestinal hormoner co-skilles fra enteroendocrine L-celler som svar på matinntak17,18. GLP-2 er anerkjent som en viktig faktor for intestinal helbredelse, regulering av slimhinne apoptose og forbedring av barrierefunksjon av si19,20,21,22. Basert på litteraturen, hypotetisk gjennomsnitt vi at endogene hormoner er avgjørende for kompenserende hyperproliferation forekommer i adaptiv respons etter skade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi en allment tilgjengelig metode for å studere SI skade og regenerering i en musemodell. Et bredt utvalg av prekliniske dyr modeller av intestinal skade eksisterer, men det er viktig vi forstår at hver modell er unik og at endepunktene må være hensiktsmessig å svare på spørsmålet om forskning. Denne modellen er utmerket til å studere adaptiv respons på skade, men endepunktene bør endres når du bruker modellen som en pre-klinisk modell av mukositt. Imidlertid er oversettelse fra dyremodeller til pas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en ubegrenset bevilgning fra Novo nordisk Center for Basic metabolsk Research og Lundbeck Foundation.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscienze. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
