Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para estabelecer pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha e usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite.

Abstract

A adaptação intestinal é o mecanismo compensatório natural que ocorre quando o intestino é perdido devido ao trauma. As respostas adaptativas, como a proliferação de células criptas e o aumento da absorção de nutrientes, são críticas na recuperação, porém pouco compreendidas. Compreender o mecanismo molecular por trás das respostas adaptativas é crucial para facilitar a identificação de nutrientes ou drogas para melhorar a adaptação. Diferentes abordagens e modelos têm sido descritos em toda a literatura, mas uma forma descritiva detalhada de executar os procedimentos é necessária para obter dados reprodutíveis. Aqui, nós descrevemos um método para estimar pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida nos ratos. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha, assim como usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite. Algumas das etapas críticas dentro do método descrito são a remoção e pesagem do intestino delgado e o sistema de software bastante complexo sugerido para a mensuração desta técnica. Estes métodos têm as vantagens que não são demorados, e que eles são rentáveis e fáceis de realizar e medir.

Introduction

A adaptação intestinal é o mecanismo compensatório natural que ocorre quando o intestino é perdido devido à doença ou cirurgia^1,2. Após o trauma, o intestino sofre uma resposta adaptativa morfométrica e funcional, caracterizada por proliferação de células cripta e aumento da absorção de nutrientes³. Esta etapa é crítica na recuperação, contudo mal compreendida. Os estudos experimentais da resposta adaptativa intestinal centraram-se nas mudanças que ocorrem após o resection pequeno das entranhas nos ratos, nos ratos, e nos porcos, mas em compreender o mecanismo molecular atrás da resposta adaptativa em outros tipos das lesões (por exemplo, química ou bacteriana) é crucial para facilitar a identificação de nutrientes ou drogas para melhorar a adaptação. Experimentalmente, diferentes abordagens têm sido utilizadas para descrever o complexo índice molecular e celular da patologia intestinal pequena, incluindo a pontuação histopatológica e medindo o desfecho da lesão. Apesar disso, o que está ausente da literatura é uma descrição detalhada de como realizar os procedimentos necessários para obter dados reprodutíveis. Ao identificar fatores envolvidos na adaptação, tais como hormônios intestinais, um modelo animal fácil, de baixo custo e reprodutível é justificado e aqui sugerimos o uso de um modelo de mucosite intestinal induzida por quimioterapia (CIM).

Um dos pontos finais mais simples e muito informativos de ambos os ferimentos e adaptação é medir a massa do intestino delgado (SI). Nós sabemos que uma indicação do mucosite é apoptose dos enterocytes, da atrofia tempo-dependente do vilosidades e da mitose reduzida. Portanto, o exame da morfologia intestinal é altamente relevante em modelos pré-clínicos^4,5. Nos seres humanos, um declínio na citrulina plasmática, um marcador de enterócitos funcionais, correlaciona-se com os escores de toxicidade e marcadores inflamatórios⁶ além da capacidade absortiva⁷, sugerindo que este aminoácido é um excelente biomarcador de Mucosite. A citrulina pode ser medida em camundongos e ratos, e tem demonstrado excelentes correlações com o comprimento da viela⁸, a sobrevivência da cripta⁹e a mucosite induzida por radiação¹⁰.

Uma grande vantagem de medir a citrulina plasmática é a capacidade de coletar medidas repetidas de um animal. Entretanto, a amostragem múltipla do sangue nos ratos é restrita a um volume de sangue total de 6 μL/g/Week e exige o anaesthesia geral. Isso, infelizmente, também limita o uso de medições de citrulina em camundongos. Além disso, a medida da citrulina requer cromatografia líquida de alta eficiência^11,12, que é dispendiosa e demorada. Recentemente, mostramos que os níveis de citrulina em camundongos correlacionam significativamente com o peso do SI (p < 0, 1) (dados não publicados), tornando a citrulina uma medida direta refletindo a massa enterócito. Uma limitação à medida do peso do SI é a necessidade para que os ratos sejam sacrificados e assim nenhumas medidas repetidas dentro do mesmo rato são possíveis. Ainda assim, o método oferece a possibilidade de realizar uma variedade de outras análises teciduais direcionadas à questão da pesquisa, e esses fatos podem, concebìvelmente, compensar o uso adicional de animais. Nós, conseqüentemente, sugerimos usar o peso do si como um biomarcador fácil, de baixo custo, e rápido do ferimento e da adaptação nos ratos. Para garantir a reprodutibilidade e a variação analítica aceitável, o intestino deve ser cuidadosamente retirado do animal, lavado com soro fisiológico, esvaziado e seco antes da pesagem. Neste artigo, mostramos exatamente como esse procedimento é executado.

Outra característica da mucosite é a perda das células proliferantes nas criptas e uma hiperproliferação compensatória durante o período regenerativo³. O marcador celular 67 tem sido freqüentemente usado para determinar células proliferativas rápidas por meio de imunohistoquímica¹³. Embora o 67 seja um simples marcador de proliferação, tem tendência para a imprecisão, pois o 67 está presente durante todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2 e M)¹⁴. A rotulagem específica é essencial para detectar células replicantes, razão pela qual sugerimos a incorporação in situ de 5-bromo-2 ‘-desoxiuridina (BrdU), um análogo sintético da timidina, pois é largamente restrito à replicação de células na S-fase¹⁵. BrdU é injetado nos animais 150 minutos antes de sacrificar e as pilhas podem subseqüentemente ser detectadas com immunohistochemistry usando anticorpos específicos de BrdU. Neste artigo do método, nós mostramos exatamente como medir a área de pilhas immunopositive de BrdU dentro de um Crypt usando um software livre da imagem.

As alterações morfológicas e funcionais são muitas vezes estudadas em modelos de mucosite induzida por 5-FU, onde a adaptação intestinal é avaliada pela altura da viela e profundidade da cripta. Durante este estudo, verificou-se que, durante a fase aguda da mucosite, que é igual à fase de lesão, a proliferação medida pela incorporação de BrdU não está correlacionada com a profundidade da cripta. Em contraste com isso, a profundidade da cripta está significativamente correlacionada com a proliferação observada na fase de reparo da mucosite, 3 a 5 dias após a indução. Isso sugere que a fase aguda da mucosite não é mensurável apenas pela profundidade da cripta. Sugerimos que, ao usar a proliferação como um EndPoint na fase aguda de camundongos mucosite, a incorporação de BrdU deve ser preferencialmente utilizada, mas ao quantificar a hiperproliferação no estágio posterior durante a fase regenerativa, a profundidade da cripta é um razoável alternativa à incorporação do BrdU. O objetivo deste estudo foi descrever esse modelo de forma que possa ser utilizado por todos os pesquisadores, tanto no campo da oncologia, mas especialmente dos pesquisadores não familiarizados com os modelos de lesão intestinal.

O modelo descrito pode ser usado para fenótipo de modelos transgênicos de acordo com a resposta adaptativa usando o peso corporal, o peso do SI e a profundidade da cripta como endpoints. Como exemplo, mostramos aqui como utilizamos o modelo de mucosite induzida por 5-fluorouracil (5-FU) em um modelo de knock out celular com secreção insuficiente de células L¹⁶. Glucagon-como o peptide-1 (GLP-1) e glucagon-como o peptide-2 (GLP-2) são os hormônios intestinais cosecretados das L-pilhas enteroendócrinas em resposta à entrada de alimento^17,18. O GLP-2 é reconhecido como um fator importante para a cicatrização intestinal, a regulação da apoptose da mucosa e a melhora da função barreira do si¹⁹,^20,21,22. Baseado na literatura, nós supor que os hormônios endógenos são essenciais para a hiperproliferação compensatória que ocorre na resposta adaptativa após ferimento.

Protocol

Todos os métodos descritos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da legislação dinamarquesa que regem a experimentação animal (1987). Os estudos foram realizados com a permissão da Inspetoria de experimentos com animais dinamarqueses (2013-15-2934-00833) e do Comitê de ética local. Nota: camundongos fêmeas C57BL/6J (~ 20 − 25 g) foram obtidos e alojados oito por gaiola na luz padrão 12 h, ciclo escuro de 12 h com acesso livre à água e ração padrão. Os animais foram deix…

Representative Results

No primeiro experimento, induzimos a mucosite em camundongos no dia 0 e sacrificamos um grupo de camundongos por dia durante 5 dias consecutivos. Ao medir o peso do SI, verificou-se que este parâmetro diminuiu do dia 2 até o 4º dia sugerindo uma perda na massa enterócito. Verificou-se, ainda, que no 5º dia, o peso do SI não foi significativamente diferente do dia 0 (camundongos não tratados) (Figura 1). A proliferação medida pela incorporação do Br…

Discussion

Aqui, demonstramos um método amplamente acessível para estudar a lesão de SI e a regeneração em um modelo de mouse. Existe uma grande variedade de modelos animais pré-clínicos de lesão intestinal, mas é vital que entendemos que cada modelo é único e que os endpoints devem ser adequados para responder à pergunta de pesquisa. Este modelo é excelente para estudar a resposta adaptativa à lesão, mas os desfechos devem ser modificados quando se utiliza o modelo como modelo pré-clínico de mucosite. No entanto, …

Materials

5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/