Assaying kredsløb specifik regulering af voksne hippocampus neurale prækursorer celler
Summary
Formålet med denne protokol er at beskrive en fremgangsmåde til analyse af opførsel af voksne neurale stamceller/progenitorcellerne som reaktion på kemo genetisk manipulation af en specifik lokal neurale kreds.
Abstract
Adult neurogenese er en dynamisk proces, hvorved Nyaktiverede neurale stamceller (nscs) i den subgranulerede zone (SGZ) af dentate gyrus (DG) genererer nye neuroner, som integreres i et eksisterende neurale kredsløb og bidrager til specifikke hippocampus-funktioner . Vigtigere, voksne neurogenese er meget modtagelig for miljømæssige stimuli, som giver mulighed for aktivitets afhængige regulering af forskellige kognitive funktioner. Et stort udvalg af neurale kredsløb fra forskellige hjerneområder orkestrater disse komplekse kognitive funktioner. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan specifikke neurale kredsløb regulere voksne neurogenese. Her beskriver vi en protokol til at manipulere neurale kredsløb aktivitet ved hjælp af designer receptor udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) teknologi, der regulerer NSCs og nyfødte afkom i gnavere. Denne omfattende protokol omfatter stereotaxisk injektion af virale partikler, kemo genetisk stimulation af specifikke neurale kredsløb, thymidinanalog administration, vævs behandling, immunofluorescens mærkning, confokale Imaging og billeddannelse analyse af forskellige stadier af neurale prækursorceller. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner om de antigen søgnings teknikker, der anvendes til at visualisere NSCs og deres afkom, og beskriver en enkel, men effektiv måde at modutere hjerne kredsløb ved hjælp af clozapin N-oxid (CNO) eller CNO-holdige drikkevand og DREADDs-udtrykker vira. Styrken af denne protokol ligger i dens tilpasningsevne til at studere en bred vifte af neurale kredsløb, der påvirker voksne neurogenese afledt af NSCs.
Introduction
Adult neurogenese er en biologisk proces, hvorved nye neuroner er født i en voksen og integreret i de eksisterende neurale netværk1. I mennesker, denne proces sker i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvor omkring 1.400 nye celler fødes hver dag2. Disse celler er placeret i den indre del af Generaldirektoratet, som huser en neurogene niche, betegnet subgranuleret zone (SGZ). Her gennemgår hippocampus Adult neurale stamceller (nscs) en kompleks udviklingsproces for at blive fuldt funktionelle neuroner, der bidrager til reguleringen af specifikke hjernefunktioner, herunder indlæring og hukommelse, humør regulering og stress respons3 ,4,5,6. For at påvirke adfærd, voksne NSCs er stærkt reguleret af forskellige eksterne stimuli i en aktivitet afhængig måde ved at reagere på en bred vifte af lokale og distale kemiske signaler. Disse kemiske signaler omfatter neurotransmittere og neuromodulatorer og handle i en kreds specifik måde fra forskellige hjerneområder. Vigtigere, kredsløb bred konvergens af disse kemiske signaler på NSCs giver mulighed for unik og præcis regulering af stamcelle aktivering, differentiering, og skæbne beslutninger.
En af de mest effektive måder at forhøre kredsløb regulering af voksne NSCs in vivo er ved parring immunofluorescens analyse med kredsløb brede manipulationer. Immunofluorescens analyse af voksne NSCs er en almindeligt anvendt teknik, hvor antistoffer mod specifikke molekylære markører anvendes til at indikere udviklingsstadiet af voksne NSCs. Disse markører omfatter: nestin som en radial glia celle og tidlig neurale stamfader markør, Tbr2 som en mellemliggende progenitorceller markør, og DCX som en neuroblast og umoden neuron markør7. Desuden, ved at administrere thymidinanaloner såsom brdu, CIDu, Idu, og edu, cellepopulationer undergår S fase kan være individuelt mærket og visualiseret8,9,10. Ved at kombinere disse to tilgange, kan en bred vifte af spørgsmål undersøges lige fra hvordan spredning reguleres på specifikke udviklingsmæssige stadier, til hvordan forskellige stikord påvirker NSC differentiering og Neurogenesis.
Flere muligheder findes for effektivt at manipulere neurale kredsløb, herunder elektrisk stimulation, optogenetik, og chemogenetics, hver med deres egne fordele og ulemper. Elektrisk stimulation involverer en omfattende operation, hvor elektroder implanteres til en bestemt hjerneregion, som senere bruges til at transmittere elektriske signaler til at moduere en målrettet hjerneregion. Men, denne tilgang mangler både cellulære og kredsløb specificitet. Optogenetik involverer levering af virale partikler, at indkode en lys aktiveret receptor, der stimuleres af en laser udsendes gennem en implanteret optisk fiber, men kræver omfattende manipulationer, store omkostninger, og komplekse operationer11. Chemogenetics involverer levering af virale partikler, der koder en designer receptor udelukkende aktiveret af designer drugs eller DREADDs, som efterfølgende aktiveres af en specifik og biologisk inert ligand kendt som clozapin N-oxid (CNO)12 . Fordelen ved at udnytte DREADDs til at manipulere lokale neurale kredsløb, der regulerer voksne NSCs ligger i lethed og forskellige ruter af CNO administration. Dette giver mulighed for en mindre tidskrævende tilgang med reduceret dyre håndtering, som let kan tilpasses til langtidsundersøgelser for at moduere neurale kredsløb.
Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol er en omfattende samling af forskellige protokoller, der kræves for at kunne afhøre kredsløb regulering af voksne hippocampus Neuro Genesis, som kombinerer både immunofluorescens teknikker og kredsløb manipulationer ved hjælp af chemogenetik. Den metode, der er beskrevet i følgende protokol, er egnet til at stimulere eller hæmme et eller flere kredsløb samtidigt in vivo til at bestemme deres reguleringsfunktion på voksne neurogenese. Denne fremgangsmåde udnyttes bedst, hvis spørgsmålet ikke kræver en høj grad af tidsmæssig opløsning. Spørgsmål, der kræver præcis tidsmæssig kontrol af stimulation/hæmning på en bestemt frekvens, kan løses bedre ved hjælp af optogenetik13,14. Den fremgangsmåde, der beskrives her, er let at tilpasse til langtidsundersøgelser med minimal håndtering af dyr, især hvor stress er et stort problem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne protokol er at vurdere, hvordan manipulerende specifikke neurale kredsløb regulerer voksen hippocampus Neuro Genesis in vivo ved hjælp af en række Immunhistokemi teknikker. Assaying aktivitet afhængig regulering af voksne neurogenese medieret af specifikke neurale kredsløb er en værdifuld teknik med stort potentiale for ændringer for at studere en bred vifte af neurale kredsløb. Succesen med disse typer eksperimenter afhænger af flere faktorer, herunder nøjagtig viral levering, korrekt viral ud…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. blev støttet af National Institute of Mental Health af National Institutes of Health under Diversity supplement R01MH111773 samt en T32 uddannelse Grant T32NS007431-20. Dette projekt blev støttet af tilskud tildelt J.S. fra NIH (MH111773, AG058160 og NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Riferimenti
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
