Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.
Abstract
Die adulte Neurogenese ist ein dynamischer Prozess, bei dem neu aktivierte neuronale Stammzellen (NSCs) in der subgranularen Zone (SGZ) des Dentatgyrus (DG) neue Neuronen erzeugen, die sich in einen bestehenden neuronalen Kreislauf integrieren und zu spezifischen Hippocampusfunktionen beitragen. . Wichtig ist, dass die adulte Neurogenese sehr anfällig für Umweltreize ist, die eine aktivitätsabhängige Regulierung verschiedener kognitiver Funktionen ermöglichen. Eine breite Palette von neuronalen Schaltkreisen aus verschiedenen Gehirnregionen orchestriert diese komplexen kognitiven Funktionen. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie bestimmte neuronale Schaltkreise die Adult Neurogenese regulieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise mit Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) Technologie aktiviert werden, die NSCs und neugeborene Nachkommen bei Nagetieren reguliert. Dieses umfassende Protokoll umfasst die stereotaxic-Injektion von Viruspartikeln, die chemogenetische Stimulation bestimmter neuronaler Schaltkreise, die analoge Verabreichung von Thymidin, die Gewebeverarbeitung, die Immunfluoreszenzkennzeichnung, die konfokale Bildgebung und die Bildgebung. Analyse verschiedener Stadien neuronaler Vorläuferzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zu Antigen-Retrieval-Techniken zur Visualisierung von NSCs und deren Nachkommen und beschreibt eine einfache, aber effektive Möglichkeit, Gehirnkreise mit Clozapin-N-Oxid (CNO) oder CNO-haltigem Trinkwasser zu modulieren und DREADDs-exzierende Viren. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Anpassungsfähigkeit, eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen, die die von NSCs abgeleitete Adult Neurogenese beeinflussen.
Introduction
Adult Neurogenesis ist ein biologischer Prozess, durch den neue Neuronen in einem Erwachsenen geboren und in die bestehenden neuronalen Netzwerke integriert werden1. Beim Menschen findet dieser Prozess im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus statt, wo täglich etwa 1.400 neue Zellen geboren werden2. Diese Zellen befinden sich im inneren Teil der DG, der eine neurogene Nische, die so genannte subgranulare Zone (SGZ), beherbergt. Hier durchlaufen hippocampale adulte neuronale Stammzellen (NSCs) einen komplexen Entwicklungsprozess, um voll funktionsfähige Neuronen zu werden, die zur Regulierung spezifischer Gehirnfunktionen beitragen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, Stimmungsregulierung und Stressreaktion3 ,4,5,6. Um das Verhalten zu beeinflussen, werden erwachsene NSCs durch verschiedene externe Reize in einer aktivitätsabhängigen Weise stark reguliert, indem sie auf eine Reihe lokaler und distaler chemischer Hinweise reagieren. Diese chemischen Hinweise umfassen Neurotransmitter und Neuromodulatoren und handeln in einer Schaltung spezifische Weise aus verschiedenen Gehirnregionen. Wichtig ist, dass die kreisweite Konvergenz dieser chemischen Hinweise auf NSCs eine einzigartige und präzise Regulierung von Stammzellaktivierungs-, Differenzierungs- und Schicksalsentscheidungen ermöglicht.
Eine der effektivsten Möglichkeiten, die Schaltungsregulierung von erwachsenen NSCs in vivo abzuhören, besteht darin, die Immunfluoreszenzanalyse mit kreisweiten Manipulationen zu koppeln. Die Immunfluoreszenzanalyse von nSCs für Erwachsene ist eine häufig verwendete Technik, bei der Antikörper gegen bestimmte molekulare Marker verwendet werden, um das Entwicklungsstadium von nSCs für Erwachsene anzuzeigen. Zu diesen Markern gehören: Nestin als radiale Gliazelle und früher neuronaler Vorläufermarker, Tbr2 als zwischengeschalteter Vorläufermarker und dcx als Neuroblast und unreifer Neuronenmarker7. Zusätzlich können durch die Verabreichung von Thymidin-Analogen wie BrdU, CidU, Idu und Edu Zellpopulationen, die sich der S-Phase unterziehen, individuell beschriftet und visualisiert werden8,9,10. Durch die Kombination dieser beiden Ansätze kann eine breite Palette von Fragen untersucht werden, die von der Art und Weise, wie die Proliferation in bestimmten Entwicklungsstadien reguliert wird, bis hin zur Wirkung verschiedener Hinweise auf die NSC-Differenzierung und Neurogenese reichen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, neuronale Schaltkreise effektiv zu manipulieren, einschließlich elektrischer Stimulation, Optogenetik und Chemogenetik, jeder mit seinen eigenen Vor- und Nachteilen. Die elektrische Stimulation beinhaltet eine umfangreiche Operation, bei der Elektroden in eine bestimmte Hirnregion implantiert werden, die später verwendet werden, um elektrische Signale zu übertragen, um eine zielgerichtete Hirnregion zu modulieren. Dieser Ansatz fehlt jedoch sowohl der zellulären als auch der Schaltungssspezifität. Optogenetik beinhaltet die Lieferung von viralen Partikeln, die einen Licht-aktivierten Rezeptor kodieren, der durch einen Laser stimuliert wird, der durch eine implantierte optische Faser emittiert wird, aber umfangreiche Manipulationen, hohe Kosten und komplexe Operationen erfordert11. Chemogenetik beinhaltet die Abgabe von Viruspartikeln, die einen Designerrezeptor kodieren, der ausschließlich durch Designermedikamente oder DREADDs aktiviert wird, die anschließend durch einen spezifischen und biologisch inerten Liganden, bekannt als Clozapin-N-Oxid (CNO)12, aktiviert werden. . Der Vorteil der Verwendung von DREADDs zur Manipulation lokaler neuronaler Schaltkreise, die erwachsene NSCs regulieren, liegt in der Leichtigkeit und den verschiedenen Wegen der CNO-Administration. Dies ermöglicht einen weniger zeitaufwändigen Ansatz mit reduzierter Tierhandhabung, der für Langzeitstudien leicht anpassungsfähig ist, um neuronale Schaltkreise zu modulieren.
Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz ist eine umfassende Sammlung verschiedener Protokolle, die erforderlich sind, um die Schaltkreisregulierung der erwachsenen Hippocampus-Neurogenese erfolgreich abzuhören, die sowohl Immunfluoreszenztechniken als auch Schaltungsmanipulationen kombiniert. Chemogenetik. Die im folgenden Protokoll beschriebene Methode eignet sich zur Stimulierung oder Hemmung eines oder mehrerer Schaltkreise gleichzeitig in vivo, um ihre regulatorische Funktion auf die adulte Neurogenese zu bestimmen. Dieser Ansatz wird am besten verwendet, wenn die Frage nicht ein hohes Maß an zeitlicher Auflösung benötigt. Fragen, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Stimulation/Hemmung bei einer bestimmten Frequenz erfordern, können besser mit der Optogenetik13,14behandelt werden. Der hier beschriebene Ansatz ist leicht für Langzeitstudien mit minimalem Umgang mit Tieren geeignet, insbesondere dort, wo Stress ein großes Anliegen ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel dieses Protokolls ist es zu beurteilen, wie die Manipulation bestimmter neuronaler Schaltkreise die adulte Hippocampus-Neurogenese in vivo mit einer Reihe von Immunhistochemie-Techniken reguliert. Die aktivitätsabhängige Regulation der adulten Neurogenese, die durch bestimmte neuronale Schaltkreise vermittelt wird, ist eine wertvolle Technik mit großem Potenzial für Modifikationen, um eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen. Der Erfolg dieser Arten von Experimenten hängt von mehreren Fakto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. wurde vom National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter Diversity Supplement R01MH111773 sowie einem T32-Ausbildungsstipendium T32NS007431-20 unterstützt. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse unterstützt, die J.S. von NIH (MH111773, AG058160 und NS104530) gewährt wurden.
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Riferimenti
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
