आसीबिंग सर्किट वयस्क हिप्पोकैम्पस तंत्रिका precursor कोशिकाओं के विशिष्ट विनियमन
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक विशिष्ट स्थानीय तंत्रिका सर्किट के chemogenetic हेरफेर के जवाब में वयस्क तंत्रिका स्टेम / जनक कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन है.
Abstract
वयस्क neurogenesis एक गतिशील प्रक्रिया है जिसके द्वारा नव सक्रिय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) दंत चिकित्सा gyrus के subgranular क्षेत्र (एसजीजेड) में (DG) नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करते हैं, जो एक मौजूदा तंत्रिका सर्किट में एकीकृत और विशिष्ट हिप्पोकैम्पस कार्यों के लिए योगदान . महत्वपूर्ण बात, वयस्क neurogenesis अत्यधिक पर्यावरण उत्तेजनाओं के लिए अतिसंवेदनशील है, जो विभिन्न संज्ञानात्मक कार्यों की गतिविधि पर निर्भर विनियमन के लिए अनुमति देता है. विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से तंत्रिका सर्किट की एक विशाल रेंज इन जटिल संज्ञानात्मक कार्यों आर्केस्ट्रा. इसलिए यह समझने के लिए कैसे विशिष्ट तंत्रिका सर्किट वयस्क neurogenesis को विनियमित महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय डिजाइनर रिसेप्टर का उपयोग कर तंत्रिका सर्किट गतिविधि में हेरफेर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (DREADDs) प्रौद्योगिकी है कि NSCs और कृन्तकों में नवजात संतान को नियंत्रित करता है. इस व्यापक प्रोटोकॉल वायरल कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन, विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के chemogenetic उत्तेजना, थाइमिडीन अनुरूप प्रशासन, ऊतक प्रसंस्करण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग, confocal इमेजिंग, और इमेजिंग भी शामिल है तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के विभिन्न चरणों का विश्लेषण. इस प्रोटोकॉल एंटीजन पुनर्प्राप्ति की तकनीक पर विस्तृत निर्देश प्रदान करता है NSCs और उनकी संतान कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया और एक सरल, अभी तक प्रभावी तरीका clozapine एन-ऑक्साइड (CNO) या CNO युक्त पीने के पानी का उपयोग कर मस्तिष्क सर्किट modulate करने के लिए और DREADDs-अतिश: वायरस. इस प्रोटोकॉल की ताकत तंत्रिका सर्किट की एक विविध रेंज है कि एनएससी से व्युत्पन्न वयस्क neurogenesis को प्रभावित अध्ययन करने के लिए अपनी अनुकूलन क्षमता में निहित है.
Introduction
प्रौढ़ तंत्रिकाजनन एक जैविक प्रक्रिया है जिसके द्वारा नए न्यूरॉन्स का जन्म वयस्क में होता है और मौजूदा तंत्रिका नेटवर्क1में एकीकृत होता है . मनुष्यों में, यह प्रक्रिया हिप्पोकैम्पस के डेन्टीट gyrus (डीजी) में होती है, जहां प्रत्येक दिन लगभग 1,400 नई कोशिकाएं पैदा होती हैं2। ये कोशिकाएं डीजी के भीतरी भाग में रहती हैं, जो न्यूरोजेनिक आला को आश्रय देती है, जिसे उपकणीय क्षेत्र (एसजीजेड) कहा जाता है। यहाँ, हिप्पोकैम्पस वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल (NSCs) एक जटिल विकास प्रक्रिया से गुजरना पूरी तरह कार्यात्मक न्यूरॉन्स कि विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों के विनियमन में योगदान बनने के लिए, सीखने और स्मृति सहित, मूड विनियमन, और तनाव प्रतिक्रिया3 ,4,5,6. व्यवहार को प्रभावित करने के लिए, वयस्क एनएससी अत्यधिक स्थानीय और दूरस्थ रासायनिक संकेतों की एक सरणी का जवाब देकर एक गतिविधि निर्भर तरीके से विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित कर रहे हैं. इन रासायनिक संकेतों न्यूरोट्रांसमीटर और neuromodulators शामिल हैं और विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से एक सर्किट विशिष्ट तरीके से कार्य. महत्वपूर्ण बात, NSCs पर इन रासायनिक संकेतों के सर्किट व्यापक अभिसरण स्टेम सेल सक्रियण, भेदभाव, और भाग्य निर्णय के अद्वितीय और सटीक विनियमन के लिए अनुमति देता है.
विवो में वयस्क एनएससी के सर्किट विनियमन से पूछताछ करने के लिए सबसे प्रभावी तरीकों में से एक सर्किट व्यापक जोड़तोड़ के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण जोड़ना है। वयस्क एनएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण एक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है, जहां वयस्क एनएससी के विकासात्मक चरण को इंगित करने के लिए विशिष्ट आणविक मार्करों के विरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। इन मार्करों में शामिल हैं: एक रेडियल ग्लिया सेल और जल्दी तंत्रिका जनक मार्कर के रूप में नेस्टिंग, एक मध्यवर्ती संतति मार्कर के रूप में Tbr2, और एक neuroblast और अपरिपक्व न्यूरॉन मार्कर के रूप में dcx7. इसके अतिरिक्त, BrdU, CidU, Idu, और Edu जैसे थाइमिडीन एनालॉगका प्रबंध करके, एस चरण से गुजर ने सेल की आबादी को व्यक्तिगत रूप से लेबल किया जा सकता है और8,9,10की कल्पना की जा सकती है। इन दो दृष्टिकोणों के संयोजन से, सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला कैसे प्रसार विशिष्ट विकासात्मक चरणों में विनियमित है से लेकर जांच की जा सकती है, कैसे विभिन्न संकेतों एनएससी भेदभाव और neurogenesis को प्रभावित करने के लिए.
कई विकल्प प्रभावी ढंग से विद्युत उत्तेजना सहित तंत्रिका सर्किट में हेरफेर करने के लिए मौजूद, optogenetics, और chemogenetics, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक. विद्युत उत्तेजना एक व्यापक सर्जरी जहां इलेक्ट्रोड बाद में एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र को मॉड्युलेट करने के लिए विद्युत संकेतों संचारित करने के लिए उपयोग किया जाता है जो एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रत्यारोपित कर रहे हैं शामिल है. हालांकि, इस दृष्टिकोण दोनों सेलुलर और सर्किट विशिष्टता का अभाव है. Optogenetics वायरल कणों कि एक प्रकाश सक्रिय रिसेप्टर कि एक प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से उत्सर्जित एक लेजर द्वारा प्रेरित है सांकेतिक प्रेमीकरण की डिलीवरी शामिल है, लेकिन व्यापक जोड़तोड़ की आवश्यकता है, बड़ी लागत, और जटिल सर्जरी11. Chemogenetics वायरल कणों है कि एक डिजाइनर रिसेप्टर विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं या DREADDs द्वारा सक्रिय सांकेतिक संबंधों की डिलीवरी शामिल है, जो बाद में एक विशिष्ट और जैविक रूप से निष्क्रिय ligand द्वारा सक्रिय कर रहे हैं clozapine एन-ऑक्साइड (CNO)12 के रूप में जाना जाता है . वयस्क NSCs को विनियमित है कि स्थानीय तंत्रिका सर्किट में हेरफेर करने के लिए DREADDs का उपयोग का लाभ आसानी और CNO प्रशासन के विभिन्न मार्गों में निहित है. यह कम पशु हैंडलिंग के साथ एक कम समय लेने वाली दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है, जो आसानी से तंत्रिका सर्किट को मॉड्युलेट करने के लिए दीर्घकालिक अध्ययन के लिए अनुकूलनीय है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण विभिन्न प्रोटोकॉल का एक व्यापक संग्रह है जो वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के सर्किट विनियमन को सफलतापूर्वक पूछताछ करने के लिए आवश्यक है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक और सर्किट जोड़-तोड़ दोनों को जोड़ती है रसोजेनेटिक्स का उपयोग करना। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित विधि उत्तेजक या एक या एकाधिक सर्किट एक साथ vivo में बाधा वयस्क neurogenesis पर अपने नियामक समारोह निर्धारित करने के लिए के लिए उपयुक्त है. इस दृष्टिकोण सबसे अच्छा प्रयोग किया जाता है अगर सवाल लौकिक संकल्प के एक उच्च डिग्री की जरूरत नहीं है. एक निश्चित आवृत्ति पर उत्तेजना/अवरोध के सटीक अस्थायी नियंत्रण की आवश्यकता वाले प्रश्नों को ऑप्टोजेनेटिक्स13,14का उपयोग करके बेहतर ढंग से संबोधित किया जा सकता है । यहाँ वर्णित दृष्टिकोण आसानी से कम से कम पशु से निपटने के साथ दीर्घकालिक अध्ययन के लिए अनुकूलित है, खासकर जहां तनाव एक प्रमुख चिंता का विषय है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य का आकलन कैसे विशिष्ट तंत्रिका सर्किट जोड़ तोड़ इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों की एक श्रृंखला का उपयोग कर विवो में वयस्क हिप्पोकैम्पस neurogenesis को नियंत्रित करता है. विशिष्ट तंत्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. विविधता अनुपूरक R01MH111773 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक T32 प्रशिक्षण अनुदान T32NS007431-20. इस परियोजना NIH (MH111773, AG058160, और NS104530) से जे एस को दिए गए अनुदान से समर्थित किया गया था.
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
Riferimenti
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