Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes
Summary
A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.
Abstract
El uso de células derivadas de hiPSC representa un valioso enfoque para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSCs derivada de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del gene (SNCA) de alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson (EP)-las poblaciones neuronales dopaminérgicas pertinentes. La acumulación de pruebas ha demostrado que altos niveles de SNCA son causales para el desarrollo de PD. Reconociendo la insatisfecha necesita establecer nuevos enfoques terapéuticos para la EP, especialmente aquellos dirigidos a la regulación de la expresión del SNCA , recientemente desarrolló un sistema CRISPR/dCas9-metilación-basado en el ADN para modular epigenéticamente SNCA transcripción por enriquecer los niveles de metilación en la región reguladora del intrón 1 de SNCA . Para entregar el sistema, que consta de un muerto (desactivado) versión de Cas9 (dCas9) fusionado con el dominio catalítico de la 3A de enzima metiltransferasa de ADN (DNMT3A), se utiliza un vector lentivirales. Este sistema se aplica a las células con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y reduce los niveles de proteína y SNCA-mRNA por cerca de 30% a través de la metilación del ADN específica del SNCA intrón 1. El downregulation del afinado de los niveles SNCA rescata fenotipos celulares relacionados con la enfermedad. En el protocolo actual, nuestro objetivo es describir un procedimiento paso a paso para diferenciarse hiPSCs en células progenitoras neurales (NPCs) y el establecimiento y validación de los análisis de Pirosecuenciación para la evaluación del perfil de metilación en el SNCA intrón 1. Para describir más detalladamente el sistema de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizado en estos experimentos, este protocolo describe cómo producir, purificar y concentrar vectores lentivirales y destacar su idoneidad para aplicaciones de edición de genoma y epigenoma utilizando hiPSCs y NPCs. El protocolo es fácilmente adaptable y puede utilizarse para producir lentivirus de alto título para aplicaciones in vitro e in vivo.
Introduction
Múltiples plataformas de edición de epigenoma han desarrollado recientemente para cualquier secuencia de ADN en las regiones que controlan la expresión de gene1,2. Las herramientas de edición de epigenoma creadas están diseñadas para (i) regular la transcripción, (ii) alterar modificaciones post-traduccionales de las histonas, (iii) modificar la metilación del ADN y (iv) modular las interacciones del elemento regulador. El enfoque para la fijación de los modificadores de la transcripción de la cromatina a un Cas9 desactivados (muertos) (dCas9) levantado de previamente desarrolladas plataformas de edición de epigenoma, como zinc dedo de proteínas (ZFPs) y efectores como activador de transcripción (cuentos), albergar un dominio potente efector transcripcional (ED) fusionados con el diseño dominio DNA-que atan (DBD)3. Los resultados del fenotipo deseado como activación o represión es definido por la molécula efectora anclada a los loci endógenos (figura 1). Para crear activadores transcripcionales programables, dCas9/gRNA módulos están vinculados con VP164,5,6 (figura 1A), un dominio de activación viral que recluta Pol II y la maquinaria de transcripción general. La modificación de este sistema ha incluido VP64, un tetrámero de dominios VP16, proporcionando una activación más robusto tipo5,6. El sistema ha sido empleado con éxito para activar regiones de codificación y los dirigidos a promotores y elementos reguladores. Lo importante es que, aunque las moléculas VP64 no modifican directamente la estructura de la cromatina en la región de destino, recluta a modificadores de la cromatina que se unen los resultados en la deposición de las marcas activa (eucromatina), como la acetilación de H3/H4 y H3 K4 di / Tri-metilación5,6. Además VP64, la subunidad p65 del humano complejo NF-kB ha sido anclada a la dCas9/gRNA módulo7. Curiosamente, la inmovilización de estos efectores a las regiones corriente arriba de los sitios de inicio de transcripción (TSSs) a promotores da como resultado una inducción del gen fuerte. Sin embargo, efectores VP64 y p65 también pueden ejercer efectos activatory al ser enlazadas a las regiones ubicadas aguas abajo de TSSs y potenciadores distal7,8. Para provocar una respuesta transcripcional más robusta, múltiples fusiones VP64 dCas9 o dCas9-p65 deben reclutarse a un solo objetivo locus9,10. Así, el reciente desarrollo de próxima generación activadores, que contratar varios dominios efector por un complejo dCas9-gRNA sola, como SunTag, ha dado como resultado una capacidad de activación más fuerte comparación con dCas9-VP64 de contrapartes fusion11 , 12. una mejor activación transcripcional ha sido obtenida mediante la fusión de VP64, p65 y Rta (VPR), un dominio de transactivación de gamma-herpesvirus, el C-terminal de dCas913 (figura 1A). Sistemas similares de CRISPR/dCas9 se han desarrollado para la represión de destino específico (figura 1B).
Represión del gen endógeno puede lograrse con fusiones de represor dirigido a través de una variedad de mecanismos (figura 1B). Se ha demostrado que CRISPR/dCas9 sistemas, relacionados con el represor DBD (incluso sin un dominio efector/s), eficaz pueden silenciar genes mientras que atado a un promotor o upstream, downstream-TSS regiones3,6 ,14. Los efectos sobre la transcripción es causada por la interferencia estérica de unión del factor de transcripción y el procesamiento de ARN polimerasa. Sin embargo, se necesitan enfoques más integrales, como represión génica por impedimento estérico sola a menudo no es suficiente para silenciar robusto. El reciente desarrollo de la próxima generación de silenciadores basados en sistemas de CRISPR/dCas9 con dominios represor transcripcional (TRD), modificadores de la histona (H3-K9 di-/ tri-metilación, H3-K27 di-/ tri-metilación; H3-K36 di-/ tri-metilación, desacetilación H3/H4) y la metilación del ADN (GPC) dirigida a la construcción de herramientas epigenéticas permitiendo más robusto silenciamiento efectos4,5,15,16, 17,18,19,20. Se ha demostrado que el reclutamiento de estos modificadores epigenéticos en el ADN puede conducir a la formación de cromatina más condensada y cerrada, que normalmente generan un silenciamiento más potente resultado21,22. El dominio silenciamiento más comúnmente utilizado con DBD es la caja asociada a Krüppel (Cascarudo)4,5. La contratación del factor se ha demostrado para corresponder con los cambios de la cromatina; sin embargo, los mecanismos de estas modificaciones deben ser elucidadas16,17,18. Recientemente, se ha demostrado que la localización de KRAB al ADN puede promover al montaje de la histona metiltransferasa SETDB1 y los complejos de NuRD histona desacetilación (HDAC), sugiriendo la posibilidad de que estas interacciones median la formación de condensación de la cromatina y silenciamiento transcripcional del3,13. Como un enfoque alternativo, los dominios efectores se pueden fusionar a DBD para crear una proteína silenciamiento epigenética personalizada. Este sistema cataliza directamente represivas marcas de ADN o modificaciones de las histonas.
Recientemente, el uso de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos anclada a la enzima DNMT3A ha sido repurposed para desactivación transcripcional. DNMT3A cataliza la metilación del ADN que ejerce represión transcripcional durante la formación de la heterocromatina en promotores de genes endógenos y otras regiones reguladoras (figura 1B)18,20. McDonald et al.18 y20 de Vojta et al fueron los primeros autores para informar que la metilación del ADN puede utilizarse para silenciamiento de epigenoma o represión, demostrando que el sistema de fusión de plásmido-entrega dCas9-DNMT3A potentemente puede mejorar metilación de la citosina en el TSS18,20. McDonald ‘ s y compañeros de trabajo demostraron que el empleo de la estrategia puede resultar en una reducción significativa (alrededor del 40%) en un gen supresor de tumores, los niveles de mRNA de CDKN2A 18. Del mismo modo, dirigida a la región unmethylated promotor de los genes de BACH o IL6ST muestra mayor metilación CpG que se ha correlacionado con una reducción de doble en la expresión génica del20. Nuestro laboratorio recientemente ha reutilizar el uso de la metilación del ADN para atenuar los resultados patológicos de SNCA sobreexpresión (figura 2)23. La estrategia se basa en la mejora selectiva en la metilación del ADN en la región del intrón 1 de SNCA , como fue divulgado previamente para ser hypomethylated en EP y demencia de Lewy (DLB) los cuerpos cerebros24,25, 26. Esta hipometilación se ha relacionado con sobreexpresión del SNCA , ofreciendo así un atractivo objetivo para la intervención terapéutica24,27,28. Nos recientemente mostró un bajo nivel de metilación del ADN en el intrón 1 del SNCA región en NPCs dopaminérgico derivado hiPSC Obtenido de un paciente de PD con el SNCA la triplicación de la23. La ventaja de este modelo experimental es que los PNJs pueden ser propagados enérgicamente en la cultura o más diferenciados en neuronas maduras, lo que permite una prueba eficiente identificar factores genéticos que median en fenotipos celulares, incluyendo oxidativo estrés y apoptosis29. Además, este modelo de sistema permite a los científicos a recapitular los acontecimientos del desarrollo que ocurrieron antes de la aparición de los síntomas en los pacientes. Además, NPCs hiPSC derivados representan una gran herramienta para poner a prueba las vías celulares y moleculares asociadas con la expresión génica. Lo importante, NPCs hiPSC derivados combinados con tecnología CRISPR/Cas9-epigenoma pueden facilitan enormemente el desarrollo de “drogas de última generación” para muchas enfermedades neurodegenerativas.
Para reducir niveles patológicos de expresión SNCA, recientemente desarrollamos un lentivirus sistema basado en que una proteína de fusión dCas9-DNMT3A y gRNA a específicamente la metilación CpG objetivo dentro del SNCA intrón 1 (figura 2A)23. Este protocolo describe vectores lentivirales (LV) diseño y producción en detalle. LVs representan un medio eficaz de ofrecer componentes CRISPR/dCas9 por varias razones, a saber: (i) su capacidad para llevar la DNA voluminoso inserciones, (ii) una alta eficiencia de transducción de una amplia gama de células, incluyendo células divisorias y nondividing30 y (iii) su capacidad para inducir respuestas inmunogénicas y citotóxicas mínima. Recientemente, aplicó el sistema del LV a neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y demostró el potencial terapéutico de LVs para la entrega de la edición de epigenoma metilación herramientas23 ( Figura 2B). De hecho, un sistema del LV-gRNA/dCas9-DNMT3A causa un aumento significativo en la metilación del ADN en la región del intrón 1 del SNCA . Este aumento se corresponde con la reducción de los niveles de mRNA y proteína SNCA 23. Por otra parte, downregulation del SNCA rescata fenotipos relacionados con la PD en el SNCA triplicación/hiPSC-derivado dopaminérgico neuronas (p. ej., mitocondrial ROS producción celular viabilidad y)23. Importante aún, hemos demostrado que la reducción en la expresión de SNCA por el sistema del LV-gRNA-dCas9-DMNT3A es capaz de revertir los fenotipos característicos de neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente de PD que llevó a la SNCA triplicación, como ROS mitocondriales producción y célula viabilidad23. El objetivo de este protocolo es 1) para indicar el protocolo de producción y concentración de una plataforma de LV optimizada para generar alta cuchicheaba preparaciones virales y 2) para describir la diferenciación de hiPSCs en NPCs con motivos para ser dopaminérgico maduro las neuronas31,32 y la caracterización de los niveles de metilación de la región específica dentro del SNCA intrón 1.
Lentivirales plataformas tienen una gran ventaja sobre la plataforma más popular de vector, es decir, adeno-asociado vectores (AAVs), que es la capacidad del primero para dar cabida a grandes inserciones genética33,34. Aireación puede generarse rendimientos significativamente más altos pero poseen una capacidad de envasado bajo (< 4,8 kb), comprometer su uso para la entrega de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Así pues, parece que el LVs sería la plataforma de elección en las aplicaciones involucradas en la entrega de herramientas CRISPR/dCas9. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí será una herramienta valiosa para los investigadores que deseen entregar eficazmente epigenoma edición componentes a las células y órganos. El protocolo adicional describe la estrategia para aumentar las capacidades de producción y expresión de los vectores a través de una modificación en cis de los elementos en el vector expresión cassette30,35. La estrategia se basa en la novela el sistema desarrollado y estudiado en nuestro laboratorio y destaca su habilidad para producir partículas virales en el rango de 1010 unidades virales (VU) / ml30,35.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección para la edición de epigenoma, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido principalmente a su capacidad para (i) grandes cargas útiles de DNA y (ii) transducen eficazmente una amplia gama de dividir y células nondividing. La eficacia de empaquetado grande de las LVs es especialmente beneficiosa para las aplicaciones de embalaje de los sistemas CRISPR/dCas9 que son de gran tamaño. Desde esta perspectiva, LVs representan la plataforma de ele…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por el Kahn Neurotecnología desarrollo Premio (C.O.), institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) (NS085011 R01 para C.O.).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Riferimenti
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