Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes
Summary
Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.
Abstract
O uso de derivados de hiPSC células representa uma abordagem valiosa para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a diferenciação de hiPSCs derivado de um paciente com a triplicação do locus de gene (SNCA) alfa-synuclein para a doença de Parkinson (PD)-populações neuronal dopaminergic relevantes. Acumular provas demonstrou-se que altos níveis de SNCA são causais para o desenvolvimento de PD reconhecer o insatisfeitas precisam estabelecer novas abordagens terapêuticas para a polícia, especialmente os alvos a regulação da expressão SNCA , nós recentemente desenvolveu um sistema CRISPR/dCas9-metilação-baseado no ADN para modular epigenetically transcrição SNCA enriquecendo os níveis de metilação na região reguladora SNCA intron 1. Para entregar o sistema, consistindo de um morto (desativado) versão do Cas9 (dCas9) fundiu-se com o domínio catalítico do DNA metiltransferase enzima 3A (DNMT3A), um vetor de Lentivirus é usado. Este sistema é aplicado às células com a triplicação do locus a SNCA e reduz os níveis de proteína e SNCA-mRNA por cerca de 30% através da metilação do DNA alvo da SNCA intron 1. A aperfeiçoá-lo downregulation dos níveis SNCA resgata doença relacionada com fenótipos celulares. O protocolo atual, nosso objetivo é descrever um procedimento passo a passo para diferenciar hiPSCs em células progenitoras neurais (NPCs) e a criação e a validação dos ensaios pyrosequencing para a avaliação do perfil de metilação na SNCA intron 1. Para descrever mais detalhadamente o sistema de lentivirus-CRISPR/dCas9 usado nesses experimentos, este protocolo descreve como produzir, purificar e concentrar Lentivirus vetores e para destacar a sua adequação para Epigenoma e genoma-edição de aplicações usando hiPSCs e NPCs. O protocolo é facilmente adaptável e pode ser usado para produzir lentivírus de alta concentração para aplicações in vitro e in vivo.
Introduction
Múltiplas plataformas Epigenoma-edição foram recentemente desenvolvidas para direcionar as sequências de DNA nas regiões que controlam a expressão de gene1,2. As ferramentas de edição Epigenoma criadas destinam-se a (i) regulam a transcrição, (ii) alterar modificações do histone posttranslational, (iii) modificar a metilação do DNA e (iv) modular interações elemento regulamentar. A abordagem para ancorar os modificadores de transcrição/cromatina para um Cas9 (morto) desativado (dCas9) ressuscitou anteriormente desenvolvidas Epigenoma-edição plataformas, tais como zinco dedo proteínas (ZFPs) e efetores, como ativador de transcrição (contos), abrigando um domínio efetor transcriptional potente (ED) fundido ao domínio de ligação a DNA projetado (DBD)3. Os resultados do fenótipo desejado como ativação ou repressão é definida pela molécula efetora ancorada ao Locus endógenos (Figura 1). Para criar ativadores transcricionais programáveis, dCas9/gRNA módulos estão ligados à VP164,5,6 (figura 1A), um domínio de ativação viral que recrutas Pol II e a maquinaria de transcrição geral. A modificação deste sistema incluiu VP64, um tetrâmero de domínios VP16, fornecendo um ainda mais robusta5,taxa de ativação6. O sistema tem sido empregado com sucesso para ativar regiões não-codificadoras e codificação, orientando os promotores e dos elementos reguladores. Importante, mesmo que VP64 moléculas diretamente não modifique a estrutura da cromatina na região de destino, ele recruta modificadores de cromatina, que se ligam os resultados no depoimento das marcas ativo (eucromatina), incluindo como acetilação H3/H4 e H3-K4 di / Tri-metilação5,6. Além de VP64, a subunidade p65 do NF-κB humano complexo tem sido amarrada ao dCas9/gRNA módulo7. Curiosamente, o tethering desses efetores às regiões montante dos locais de início da transcrição (TSSs) e dentro de promotores resulta em uma indução do gene forte. No entanto, VP64 e p65 efetores também podem exercer os efeitos activatory enquanto ser linkadas para as regiões situadas a jusante de TSSs e no distal potenciadores de7,8. Para eliciar uma resposta transcricional mais robusta, várias fusões de dCas9-VP64 ou dCas9-p65 deveriam ser recrutados para um destino único locus9,10. Como tal, o desenvolvimento recente de ativadores de próxima geração, que recrutar vários domínios efetoras por um complexo único dCas9-gRNA, tais como SunTag, resultou em uma capacidade de ativação mais forte comparando com dCas9-VP64 fusão homólogos11 , 12. uma ativação transcricional melhorada foi obtida através da fusão de VP64, p65 e Rta (VPR), um domínio do transactivation do gama-herpesviruses, para o C-terminal da dCas913 (figura 1A). Desenvolveram-se sistemas semelhantes de CRISPR/dCas9 para a repressão de destino específico (figura 1B).
Repressão do gene endógeno pode ser conseguido com fusões repressor projetadas através de uma variedade de mecanismos (figura 1B). Foi demonstrado que sistemas CRISPR/dCas9, ligados ao repressor DBD (mesmo sem um domínio efetor/s), com eficiência podem silenciar a expressão de gene, enquanto amarrados a um promotor ou montante/jusante-TSS regiões3,6 ,14. Os efeitos na transcrição é causado por interferência estérica de ligação do fator de transcrição e processamento de RNA polimerase. No entanto, são necessárias abordagens mais abrangentes, como repressão do gene por estérico sozinho muitas vezes não é suficiente para silenciar robusto. O recente desenvolvimento da próxima geração de silenciadores baseado em sistemas CRISPR/dCas9 carregando domínios transcricional repressor (TRDs), modificadores de histona (H3-K9 di-/ tri-metilação, H3-K27 di-/ tri-metilação; H3-K36 di-/ tri-metilação, deacetilação de histona H3/H4) e metilação de DNA (CpG), levado à construção de ferramentas epigenéticas, permitindo mais robusto silenciar efeitos4,5,15,16, 17,18,19,20. Foi demonstrado que o recrutamento desses modificadores epigenéticas ao DNA pode levar à formação de cromatina mais condensada e fechada, que normalmente geram um mais potente silencioso resultado21,22. O domínio de silenciar mais comumente usado com DBDs é o caixa Krüppel-associado (CASCUDO)4,5. O recrutamento do fator foi demonstrado para corresponder com as alterações da cromatina; no entanto, os mecanismos destas modificações são ainda ser elucidado16,17,18. Recentemente, tem sido demonstrado que a localização do Siri CASCUDO para DNA pode promover a montagem do methyltransferase do histone SETDB1 e os complexos de NuRD histona deacetilação (HDAC), sugerindo a possibilidade de que estas interações mediam a formação de condensação da cromatina e transcriptional silencioso3,13. Como uma abordagem alternativa, domínios effector podem ser fundidos a DBDs para criar uma proteína de silenciamento epigenética personalizada. Este sistema diretamente catalisa repressivas marcas de DNA ou modificações do histone.
Recentemente, a utilização de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos amarrados à enzima DNMT3A tem foi realocada para desativação transcricional. Dnmt3a catalisa a metilação do DNA que exerce repressão transcriptional em toda a formação de heterocromatina em promotores de genes endógenos e outras regiões reguladoras (figura 1B)18,20. McDonald et al.18 e Vojta et al20 foram os primeiros autores para relatar que a metilação do DNA pode ser usada para Epigenoma-silenciamento ou repressão, demonstrando que o sistema de fusão de dCas9-DNMT3A entregue em plasmídeo potente pode melhorar metilação de citosina em torno do TSS18,20. McDonald ‘ s e colegas demonstraram que o emprego da estratégia pode resultar em uma redução significativa (cerca de 40%) em um gene supressor de tumor, os níveis de mRNA de CDKN2A 18. Da mesma forma, visando a região unmethylated promotor dos genes BACH ou IL6ST mostra aumentada metilação de CpG que tem sido correlacionada com a expressão de gene20redução dupla. Nosso laboratório tem recentemente realocado o uso de metilação do DNA para atenuar os resultados patológicos de SNCA superexpressão (Figura 2)23. A estratégia baseia-se na seletiva do realce na metilação do DNA dentro da região de intron 1 SNCA , como anteriormente foi relatado para ser hypomethylated em PD e demência com Lewy (DLB) de corpos cérebros24,25, 26. Esta hypomethylation tem sido associada a SNCA superexpressão, oferecendo assim um alvo atraente para a intervenção terapêutica de27,24,28. Recentemente mostramos um baixo nível de metilação do DNA na SNCA intron 1 na região de hiPSC-derivado dopaminérgico NPCs obtidos de um paciente de PD com o SNCA triplicação23. A vantagem deste modelo experimental é que os NPCs podem ser robustamente propagados na cultura ou ainda mais diferenciados em neurônios maduros, permitindo uma triagem eficiente identificar fatores genéticos que medeiam fenótipos celulares, incluindo oxidativo stress e apoptose29. Além disso, este modelo sistema permite aos cientistas recapitular os eventos do desenvolvimento que ocorreram antes do aparecimento de sintomas em pacientes. Além disso, hiPSC-derivado de NPCs representam uma ótima ferramenta para testar as vias celulares e moleculares associadas a expressão gênica. Importante, NPCs derivado de hiPSC, combinados com estado-da-arte tecnologia CRISPR/Cas9-Epigenoma podem facilitar muito o desenvolvimento de “drogas de última geração” para muitas doenças neurodegenerativas.
Para reduzir níveis patológicos de expressão SNCA, recentemente desenvolvemos um sistema baseado em lentivirus carregando uma proteína de fusão de dCas9-DNMT3A e gRNA para especificamente alvo CpG do methylation dentro o SNCA intron 1 (Figura 2A)23. Este protocolo irá descrever design vetor de Lentivirus (LV) e produção em detalhe. VLS representam um meio eficaz de fornecer componentes CRISPR/dCas9 por várias razões, nomeadamente (i) sua capacidade de transportar DNA volumoso insere, (ii) uma alta eficiência de transducing uma ampla variedade de células, incluindo células de divisão e nondividing30 e (iii) sua habilidade de induzir respostas imunogênicas e citotóxicas mínimas. Recentemente, aplicamos o sistema LV para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente com a triplicação do locus a SNCA e demonstrou o potencial terapêutico de LVs para a entrega da edição de Epigenoma metilação ferramentas23 ( Figura 2B). Com efeito, um sistema de LV-gRNA/dCas9-DNMT3A ocasiona um aumento significativo na metilação do DNA na região do intron 1 SNCA . Este aumento corresponde com a redução dos níveis de SNCA mRNA e proteína23. Além disso, a SNCA downregulation resgata fenótipos relacionados com PD na SNCA triplicação/hiPSC-derivado dopaminérgico neurônios (por exemplo, mitocondrial ROS produção e célula viabilidade)23. Importante, temos demonstrado que a redução na expressão SNCA pelo sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A é capaz de reverter os fenótipos que são característicos para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente de PD que carregava a SNCA triplicação, tais como mitocondrial ROS produção e célula viabilidade23. O objetivo do presente protocolo é 1) para delinear o protocolo de produção e concentração de uma plataforma otimizada de LV para gerar alta-tittered virais preparações e 2) para descrever a diferenciação de hiPSCs em NPCs padronizada para tornar-se maduro dopaminergic os neurônios31,32 e a caracterização dos níveis de metilação da região alvo dentro SNCA intron 1.
Particulas de Lentivirus plataformas tem uma grande vantagem sobre a plataforma mais popular do vetor, ou seja adeno-associado vetores (AAVs), que é capacidade a ex de acomodar maior inserções genética33,34. AAVs podem ser gerados em rendimentos significativamente mais elevados, mas possuem uma capacidade baixa de empacotamento (< 4,8 kb), comprometer a sua utilização para fornecimento de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Assim, parece que o LVs seria a plataforma de escolha nas aplicações envolvidas no fornecimento de ferramentas CRISPR/dCas9. Portanto, o protocolo descrito aqui vai ser uma ferramenta valiosa para pesquisadores desejando entregar efetivamente Epigenoma-editando componentes para as células e órgãos. O protocolo mais descreve a estratégia para aumentar as capacidades de produção e expressão dos vetores através de uma modificação na CEI dos elementos dentro do vetor expressão gaveta30,35. A estratégia é baseada no romance o sistema desenvolvido e estudado em nosso laboratório e destaca sua capacidade de produzir partículas virais no intervalo de 1010 unidades virais (VU) /mL30,35.
Protocol
Representative Results
Discussion
VLS começaram a emergir como o veículo de escolha para edição Epigenoma, especialmente no contexto de doenças genéticas, principalmente devido à sua capacidade de (i) acomodar grandes cargas de DNA e (ii) transduce eficientemente uma grande variedade de dividir e células nondividing. A eficácia de grandes embalagens dos VLS é especialmente benéfica para as aplicações que envolvem embalagens dos sistemas CRISPR/dCas9 que são de grandes dimensões. Nesta perspectiva, LVs representam a plataforma de escolha pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de desenvolvimento de Neurotecnologia Kahn (de The O.C.) e o nacional institutos de saúde nacionais Instituto de doenças neurológicas e Stroke (NINDS/NIH) (R01 NS085011 de O.C.).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Riferimenti
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