न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो लेन्टिवायरल इंजीनियरिंग के आधार पर, जंगली-प्रकार के दिमाग में उनके सह-ट्रांसप्लांटेशन और “परीक्षण” और “नियंत्रण” डेरिवेटिव के युग्मित मॉर्फोमीट्रिक मूल्यांकन, इस विधि से नियोकोर्टिकल के विवो जीन नियंत्रण में सटीक मॉडलिंग की अनुमति देता है एक सरल और सस्ती तरीके से न्यूरॉन आकारिकी.
न्यूरोनल साइटोआर्किटेक्चर का जीन नियंत्रण वर्तमान में गहन जांच का विषय है। यहाँ वर्णित एक सरल विधि neocortical प्रक्षेपण न्यूरॉन आकृति विज्ञान के vivo जीन नियंत्रण में अध्ययन करने के लिए विकसित की है. इस विधि पर आधारित है (1) “परीक्षण” और “नियंत्रण” कोशिकाओं के रूप में न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो leniviral इंजीनियरिंग में, (2) जंगली प्रकार के दिमाग में उनके सह प्रत्यारोपण, और (3) उनके न्यूरॉन डेरिवेटिव के युग्मित morphometric मूल्यांकन. विशेष रूप से, E12.5 panneuronal से pallial अग्रदूतों, आनुवंशिक रूप से लेबल दाताओं, इस उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं. वे चयनित प्रमोटरों और tetON / ऑफ प्रौद्योगिकी का लाभ लेने के लिए इंजीनियर हैं, और वे नि: शुल्क हाथ नवजात पार्श्व निलय में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. बाद में, प्राप्तकर्ता दिमाग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोफाइलिंग पर, प्रतिरोपित न्यूरॉन्स के silhouettes NeurphologyJ खुला स्रोत सॉफ्टवेयर में खिलाया जाता है, उनके morphometric मापदंडों निकाले जाते हैं, और औसत लंबाई और शाखा सूचकांक की गणना कर रहे हैं. अन्य तरीकों की तुलना में, यह एक तीन मुख्य लाभ प्रदान करता है: यह सस्ती कीमत पर transgene अभिव्यक्ति के ठीक नियंत्रण के प्राप्त करने की अनुमति देता है, यह केवल बुनियादी शल्य कौशल की आवश्यकता है, और यह एक सीमित के विश्लेषण पर सांख्यिकीय विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है जानवरों की संख्या. इसके डिजाइन के कारण, हालांकि, यह neuroarchitecture के गैर सेल स्वायत्त नियंत्रण को संबोधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है. इसके अलावा, यह अधिमानतः न्यूरोनल प्रवास के पूरा होने के बाद neurite आकृति विज्ञान नियंत्रण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अपने वर्तमान निर्माण में, इस विधि अति सुंदर glutamatergic neocortical न्यूरॉन वास्तुकला के जीन नियंत्रण की जांच करने के लिए tuned है. ट्रांसजेनिक अन्य विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार में EGFP व्यक्त लाइनों का लाभ उठाते हुए, यह उनकी वास्तुकला के जीन नियंत्रण को संबोधित करने के लिए फिर से उद्देश्य किया जा सकता है.
यहाँ हम एक सरल विधि हम न्यूरॉन cytoarchiketoke के vivo जीन नियंत्रण में विच्छेदन के लिए विकसित का वर्णन. न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो इंजीनियरिंग के आधार पर, नवजात मस्तिष्क में उनके प्रत्यारोपण और “परीक्षण” और “नियंत्रण” कोशिकाओं के युग्मित morphometric मूल्यांकन, यह एक में न्यूरॉन आकृति विज्ञान के ठीक नियंत्रण में परीक्षण जीन के कार्यात्मक प्रभाव अनावरण करने के लिए अनुमति देता है तेजी से और सस्ती तरीका है. न्यूरोनल वास्तुकला के विवो जीन नियंत्रण में जांच करने के लिए, तीन प्रमुख तकनीकी मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए: (1) एक पर्याप्त रूप से पैटर्न जीन के ब्याज (भारत आई ओ आई) अभिव्यक्ति और इसका एक सटीक मात्रात्मक नियंत्रण प्राप्त करना; (2) अलग न्यूरॉन silhouettes की एक ठीक से खंडित दृश्य प्राप्त करने; (3) परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करते हुए पशुओं की एक सीमित संख्या में रोजगार.
उपलब्ध होने पर, टेट्रासाइक्लिन (टीईटी) नियंत्रित transgenes शरण माउस उत्परिवर्ती लाइनों पहले मुद्दे1को संबोधित करने के लिए सबसे अच्छा उपकरण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, दैहिक transgenesis नियोजित किया जा सकता है. ऐसे मामलों में, ट्रांसजीन इलेक्ट्रोपोरेशन2 या वायरल ट्रांसडक्शन3के माध्यम से वितरित किया जाता है। इसके बाद, इसे एक महामारी के रूप में बनाए रखा जाता है (जैसे, मानक इलेक्ट्रोपोट्रेशन4पर), या यह जीनोम में एकीकृत होता है (यादृच्छिक रूप से, रेट्रोवायरल इंटीग्रेस5के माध्यम से ; या एक परिभाषित स्थान में, CRISPR-प्रमोट किए गए समजात पुनर्संयोजन (SLENDR)6 के माध्यम से ).
दूसरा, न्यूरॉन सिल्हूट दृश्य के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (क) विरल वर्दी लेबलिंग या (ख) घने अंतर लेबलिंग. विरल लेबलिंग के लिए, उन्नत Golgi की तरह तरीकों कार्यरत किया जा सकताहै7, चयनित न्यूरोनल minisets biocytin द्वारा भरा जा सकताहै 8, और नमक और मिर्च लेबलिंग एक विरल व्यक्त transgene के लिए धन्यवाद प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के एक transgene विभिन्न लिप्यंजन प्रदर्शित कर सकते हैं (Thy-EGFP)9 या stochastic पुनर्संयोजन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है (MORF)10. के लिए के रूप में (ख), कला रणनीतियों के राज्य एक बहु-फ्लैक्स्ड फ्लोरोप्रोटीन ट्रांसजीन सरणी (Brainbow)11के भीतर क्रे-मध्यस्थ stochastic पुनर्संयोजन शामिल हैं, साथ ही साथ piggyBac-transposase संचालित फ्लोरोप्रोटीन जीन के जीनोमिक एकीकरण, पहले दैहिक ट्रांसजेनेसिस (CLoNE)12के माध्यम से दिया |
तीसरे मुद्दे के लिए के रूप में, morphometric परिणाम अक्सर एक बड़े यादृच्छिक परिवर्तनशीलता से प्रभावित है, अंतर पशु मतभेद और सेल इंजेक्शन आकस्मिकताओं से शुरू होता है. इस वजह से, जानवरों की एक बड़ी संख्या आमतौर पर भारत सरकार morphometric गतिविधि का आकलन करने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति को प्राप्त करने के लिए कार्यरत है।
पहले वर्णित दृष्टिकोण अक्सर उन्नत तकनीकी कौशल पर भरोसा करते हैं और विशिष्ट वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता होती है, जो वैज्ञानिक समुदाय के भीतर उनके प्रसार को सीमित कर सकते हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हमने विवो में न्यूरोआर्किटेक्चर के जीन नियंत्रण को एक तेज और किफायती तरीके से विभाजित करने के लिए एक आसान और सरल पाइपलाइन की कल्पना की। यह एंटीब्लास्टिक ट्रांसजीन गतिविधि13के विवो मूल्यांकन में तेजी से विकसित एक समान सह-ट्रांसप्लांटेशन डिजाइन से प्रेरित है।
विशेष रूप से, यह सोचा है कि इन विट्रो इंजीनियर के सह-प्रतिरोपण “हरी” तंत्रिका अग्रदूतों (“परीक्षण” और “नियंत्रण” कोशिकाओं) एक “काला” प्राप्तकर्ता नवजात मस्तिष्क में एक साथ तीन प्रमुख मुद्दों के ऊपर सूचीबद्ध ठीक कर सकते हैं. वास्तव में, अग्रदूतों के इन विट्रो lentiviral इंजीनियरिंग में, अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में, एक न्यूनतम पर न्यूरॉन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता के रखरखाव की अनुमति देता है, अभी तक नीचे है कि आम तौर पर विवो दैहिक जोड़तोड़ में के साथ जुड़े (पहले प्रदर्शन किया 14 , 15 और हमारे अप्रकाशित परिणामों में). जीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप सटीक नियंत्रण है कि tet नियंत्रित transgenic मॉडल द्वारा प्राप्त के साथ तुलनीय है. हालांकि, इस प्रक्रिया की लागत अभी तक एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के रखरखाव से शुरू होने वालों से नीचे हैं. अगले, मुक्त हाथ सेल इंजेक्शन आसान है और कम से कम प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रत्येक मस्तिष्क में इंजेक्शन लेबल अग्रदूतों की राशि आसानी से कम से कम वितरित अग्रदूतों की एक पर्याप्त संचयी संख्या को प्राप्त करने के लिए tuned किया जा सकता है, जबकि भी एक न्यूनतम पर प्रतिरोपित जानवरों की कुल संख्या रखते हुए. पिछले नहीं बल्कि कम से कम, सह अलग fluoro लेबल के इंजेक्शन, “परीक्षण” और “नियंत्रण” अग्रदूतों और बाद में pairwise परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण अंतर पशु प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के प्रभाव प्रतिक्रिया, तक पहुँचने की अनुमति परिणामों का सांख्यिकीय महत्व, यहां तक कि सीमित संख्या में व्यक्तियों के विश्लेषण पर13.
यह जोर दिया जाना चाहिए कि, हालांकि तेजी से और सस्ते, इस विधि दो मुख्य सीमाएं हैं. सबसे पहले, यह कोशिका-स्वायत्त जीन नियंत्रण न्यूरॉन वास्तुकला की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और यह पर्यावरण नियंत्रण को संबोधित करने के लिए उपयुक्त नहीं है. दूसरा, के रूप में प्रत्यारोपित न्यूरोनल अग्रदूतों एक विषमक्रोनिकन अनुसूची द्वारा अपने अंतिम स्थान तक पहुँचने, इस विधि मॉडल neuroarchitectonics नियंत्रण पिछले प्रवास पूरा होने वाली करने के लिए बेहतर है.
इस प्रक्रिया के विशिष्ट पहलू/चरण महत्वपूर्ण हैं और इस पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, (क) ऑपरेटरों पर्याप्त रूप से एक बीएसएल-2 अनुरूप प्रयोगशाला वातावरण में lentiviruses हेरफेर करने के लिए पर्याप…
The authors have nothing to disclose.
हम इस प्रक्रिया की जल्दी स्थापित करने के लिए उनके योगदान के लिए Mihn Duc क्या धन्यवाद.
0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |