Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Sommario

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Abstract

Il controllo genico della citoarchitettura neuronale è attualmente oggetto di indagini intensive. Descritto qui è un metodo semplice sviluppato per studiare il controllo genico in vivo della morfologia del neurone di proiezione neocorticale. Questo metodo si basa su (1) ingegneria lentivirale in vitro di precursori neuronali come cellule "test" e "controllo", (2) il loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e (3) la valutazione morfometrica associata dei loro derivati neuronali. In particolare, a questo scopo vengono utilizzati precursori palliali E12.5 provenienti da donatori panneuronali, geneticamente etichettati. Sono progettati per sfruttare i promotori selezionati e la tecnologia tetON/OFF, e vengono trapiantati a mano libera in ventricoli laterali neoalari. Successivamente, al momento della profilazione immunofluorescenza dei cervelli riceventi, le sagome dei neuroni trapiantati vengono inserite nel software open source NeurphologyJ, vengono estratti i loro parametri morfometrici e vengono calcolati i dati di lunghezza e diramazione medici. Rispetto ad altri metodi, questo offre tre vantaggi principali: permette di ottenere un controllo fine dell'espressione transgenica a costi accessibili, richiede solo competenze chirurgiche di base e fornisce risultati statisticamente affidabili dopo l'analisi di un numero di animali. A causa del suo design, tuttavia, non è sufficiente affrontare il controllo non autonomo delle cellule della neuroarchitettura. Inoltre, dovrebbe essere preferibilmente usato per studiare il controllo della morfologia neurite dopo il completamento della migrazione neuronale. Nella sua formulazione attuale, questo metodo è squisitamente sintonizzato per studiare il controllo genetico dell'architettura neocorticale glutamatergica. Approfittando delle linee transgeniche che esprimono EGFP in altri tipi specifici di cellule neurali, può essere riutilizzato per affrontare il controllo genico della loro architettura.

Introduzione

Qui descriviamo un semplice metodo che abbiamo sviluppato per sezionare il controllo genico in vivo della citoarchitettura neuronale. Basato sull'ingegneria in vitro dei precursori neuronali, il loro trapianto nel cervello neonale e la valutazione morfometrica accoppiata delle cellule "test" e "controllo", permette di svelare implicazioni funzionali dei geni di prova nel controllo fine della morfologia neuronale in un modo veloce e conveniente. Per studiare il controllo genico in vivo dell'architettura neuronale, devono essere affrontate tre questioni tecniche chiave: (1) ottenere un'espressione gene of-interest (GOI) adeguatamente modellata e un controllo quantitativ....

Protocollo

Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dal SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Generazione di piscine progenitori "verdi" ingegnerizzate

1. Preparazione della piscina "verde"
   1. Accoppiare una femmina di tipo selvaggio CD1 con un Fondatore di Mtapt^{EGFP / s} 16 . Eutanasia la diga incinta per lussazione cervicale a 12,5 giorni dopo il coitum (giorno 0 è determinato dall'ispezione vaginale della spina) e raccoglie gli embrioni della giornata embrionale 12.5 (E12.5). Impostarli in singoli pozzi di una piastra multi-w....

Risultati

Esistono cinque set di dati primari che forniscono informazioni utili sugli aspetti chiave della procedura, il primo è (1) l'efficienza della trasduzione e co-trasduzione dei precursori neurali da parte dei vettori lentivirali. (2) Un esempio di caratteristiche chiave dei promotori impiegati per guidare il "gene di prova". (3) Un esempio di cellule ingegnerizzate pronte per il trapianto. (4) Una vignetta che include i dettagli procedurali chiave della microiniezione cellulare nel cervello.......

Discussione

Aspetti/passaggi specifici di questa procedura sono fondamentali e richiedono particolare attenzione. In primo luogo, (a) gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per manipolare in modo sicuro i lentivirus in un ambiente di laboratorio conforme a BSL-2. In secondo luogo, (b) prima di mescolare "test" e "controllo" preparati neurali, è obbligatorio lavare attentamente le due sospensioni neurosfera corrispondenti come descritto, al fine di prevenire qualsiasi infezione incrociata ritardata dei due preparati a c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 0,3 mL	BD	320840	conservare a RT
0,45 μ m filtro sterile	Millex-HV	SLHU033RS	negozio presso RT
12 piastra multipozzetto	Falcon	353043	negozio presso RT
1X PBS	Gibco	14190-094	negozio presso RT
24 piastra multipozzetto	Falcon	351147	negozio presso RT
anticorpo anti-EGFP, policlonale di pollo, RRID:AB_371416	Tebubio	GTX13970	negozio a -20 ° Anticorpo
anti-RFP C, monoclonale di ratto, RRID:AB_10795839	Antibodies Online	ABIN334653	negozio a -20 °
C anticorpo anti-Tubb3, monoclonale di topo, RRID:AB_2313773	Covance	MMS-435P	conservare a -20 ° C
Kit assemblaggi tubo aspiratore per pipette microcapillari calibrate Sigma		A5177-5EA	negozio presso RT
Lampada a luce blu	Nightsea	BLS2	negozio presso RT
Capillari borosilicati	Kwik-Fil	TW150-4	negozio presso RT
BSA	Sigma	A9647	negozio presso -20 ° C
Bü camera di raffreddamento	Sigma	BR719520	0,0025 mm2, 0,100 mm
Mezzo di crioinclusione (Killik)	Bio-Optica	05-9801	negozio presso RT
DAPI	Sigma	D9542	negozio a -20 ° C
Stampo per inclusione monouso	Bio-Optica	07MP7070	negozio presso RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	negozio a +4 ° C
Dnase I	Roche	10104159001	negozio a -20 ° C
Doxiciclina	Sigma	D1822	negozio a -20 ° C
Pinza Dumont #3c	Fine Science Tools	11231-20	negozio presso RT
Dumont pinza #5	Fine Science Tools	11251-20	negozio presso RT
EGF	Gibco	PHG0311	negozio a -20 ° C
EGTA	Sigma	E3889	negozio presso RT
FGF	Gibco	PHG0261	negozio a -20 ° C
Forbici fini - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	negozio presso RT
Fungizone (Amfotericina B)	Gibco	negozio 15290018	a -20 ° C
Glucosio	Sigma	G8270	negozio presso RT
GlutaMAX Integratore	Gibco	35050061	negozio presso RT
Capra anti-pollo Alexa 488	Invitrogen	A11039	negozio a -20 ° C
Capra anti-ratto Alexa 594	Invitrogen	A11007	negozio a -20 ° C
Soluzione di eparina	Stem Cell Technologies	07980	negozio a -20 ° C
N2 Supplemento	Gibco	17502048	negozio a -20 ° C
Fibre ottiche	Leica	CLS150X
P1000 estrattore	Sutter Instruments	P-1000 modello
Parafilm	Bemis	PM-996	negozio presso RT
Pen Strep	Sigma	P0781	negozio a -20 ° C
Piastra di Petri	Falcon	353003	negozio presso RT
PFA	Sigma	158127	negozio presso RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	costruito in house		store a -20 ° C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	costruito in house		store a -20 °
C Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	costruito in house		store a -20 ° C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	costruito in house		store a -20 ° C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	negozio a -20 ° C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	costruito in house		store a -20 °
C Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	costruito in house		store a -20 ° C
Bisturi	Braun	BB515	negozio presso RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	negozio presso RT
Trypan blue	Gibco	15250-061	negozio presso RT
Trypsin	Gibco	15400-054	negozio a -20 ° C
Inibitore della tripsina	Sigma	T6522	conservare a -20 ° E