Intraventrikulär transplantation av konstruerade neuronala prekursorer för in vivo Neuroarkitekturstudier
Summary
Baserat på in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer, deras samtidig transplantation till vildtyp hjärnor och Parade morfometriska utvärdering av “test” och “kontroll” derivat, denna metod möjliggör noggrann modellering av in vivo gen kontroll av neokortikala neuron morfologi på ett enkelt och prisvärt sätt.
Abstract
Gen kontroll av neuronala cytoarchitecture är för närvarande föremål för intensiv utredning. Beskrivs här är en enkel metod som utvecklats för att studera in vivo gen kontroll av neokortikala projektion neuron morfologi. Denna metod är baserad på (1) in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer som “test” och “kontroll” celler, (2) deras co-transplantation till vildtyp hjärnor, och (3) Parade morfometriska utvärdering av deras neuronala derivat. Specifikt, E 12.5 pallial prekursorer från panneuronala, genetiskt märkta givare, är anställda för detta ändamål. De är konstruerade för att dra nytta av utvalda initiativtagare och tetON/OFF-teknik, och de är fria händer transplanteras in neonatal laterala ventriklar. Senare, vid immunofluorescensitering av mottagar hjärnor, silhuetter av transplanterade nervceller matas in neurphologyj programvara med öppen källkod, deras morfometriska parametrar extraheras, och genomsnittlig längd och branchning index beräknas. Jämfört med andra metoder, erbjuder detta en tre huvudsakliga fördelar: det tillåter att uppnå fin kontroll av transgenens uttryck till rimliga kostnader, det kräver bara grundläggande kirurgiska färdigheter, och det ger statistiskt tillförlitliga resultat vid analys av en begränsad antal djur. På grund av dess utformning, dock, det är inte tillräckligt för att lösa icke cell-autonom kontroll av neuroarchitecture. Dessutom, det bör företrädesvis användas för att undersöka neurit morfologi kontroll efter avslutad neuronala migration. I sin nuvarande formulering är denna metod utsökt trimmad för att undersöka gen kontroll av glutamatergic neokortikala neuron arkitektur. Dra nytta av transgena linjer som uttrycker EGFP i andra specifika neurala celltyper, det kan återanvändas för att ta itu med gen kontroll av deras arkitektur.
Introduction
Här beskriver vi en enkel metod som vi utvecklat för att dissekera in vivo gen kontroll av neuronala cytoarchitecture. Baserat på in vitro-Engineering av neuronala prekursorer, deras transplantation till neonatal hjärna och Parade morfometriska utvärdering av “test” och “kontroll” celler, det gör det möjligt att avslöja funktionella konsekvenserna av test gener i fin kontroll av neuronala morfologi i en snabbt och prisvärt sätt. För att undersöka in vivo gen kontroll av neuronala arkitektur, tre viktiga tekniska frågor måste åtgärdas: (1) att uppnå en tillräckligt mönstrad gen-of-Interest (GOI) uttryck och en noggrann kvantitativ kontroll av det; (2) få en korrekt segmenterad visualisering av distinkta neuronala silhuetter; (3) framkalla statistisk signifikans av resultat samtidigt anställa ett begränsat antal djur.
När tillgängliga, mus Mutant linjer hyser tetracyklin (tet)-kontrollerade transgener kan vara det bästa verktyget för att ta itu med den första frågan1. Alternativt kan somatisk transgenes vara anställd. I sådana fall levereras transgenen via elektroporation2 eller viral signaltransduktion3. Därefter bibehålls den som en Episome (t. ex. vid standard elektroporation4), eller det är integrerat i genomet (slumpmässigt, via antiretrovirala integras5; eller på en definierad plats, via CRISPR-befordrad homolog REKOMBINATION (slendr)6 ).
För det andra kan neuronala silhuett visualisering uppnås via (a) glesa enhetliga märkning eller (b) tät differential märkning. När det gäller glesa märkning, avancerade Golgi-liknande metoder kan användas7, utvalda neuronala minisets kan fyllas med biocytin8, och salt-och peppar märkning kan erhållas tack vare en glest uttryckt Transgene. En sådan transgen kan visa brokig transkription (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveras genom stokastisk rekombination (morf)10. När det gäller (b), State of Art strategier inkluderar CRE-medierad stokastisk rekombination inom en multi-floxed fluorprotein transgenens array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-driven genomisk integration av fluorproteingener, tidigare levereras via somatisk transgenes (klon)12.
När det gäller den tredje frågan, är morphometriska resultatet ofta påverkas av en stor slumpmässig variation, som härrör från Inter-Animal skillnader och cell-injektion oförutsedda händelser. På grund av detta, är ett stort antal djur vanligtvis används för att uppnå den statistiska kraft som krävs för att bedöma GOI morfometriska aktivitet.
De metoder som tidigare beskrivits förlitar sig ofta på avancerade tekniska färdigheter och kräver iögonfallande ekonomiska resurser, vilket kan begränsa deras spridning inom forskarvärlden. För att kringgå dessa frågor, tänkte vi en enkel och enkel pipeline för att dissekera gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på ett snabbt och prisvärt sätt. Detta är inspirerat av en liknande Co-transplantation design som tidigare utvecklats för snabb in vivo utvärdering av antiblastic transgenens aktivitet13.
Specifikt, det är tänkt att samtidig transplantation av in vitro-konstruerade “gröna” neurala prekursorer (“test” och “kontroll” celler) i en “svart” mottagare neonatal hjärna kan samtidigt fastställa de tre viktiga frågor som anges ovan. I själva verket, in vitro-lentiviral Engineering av prekursorer, i välkontrollerade förhållanden, tillåter underhåll av variationer av neuronala transgenens uttryck på ett minimum, långt under som vanligtvis förknippas med in vivo somatiska manipulationer (utförs tidigare fjorton , 15 och i våra opublicerade resultat). Den resulterande noggranna kontrollen av genuttrycket är jämförbar med den som uppnås genom tettkontrollerade transgena modeller. Kostnaderna för detta förfarande är dock långt under de som härrör från upprätthållandet av en transgen mus linje. Nästa, fri-hand cell injektion är lätt och kräver minimal träning. Dessutom kan mängden märkta prekursorer som injiceras i varje hjärna lätt justeras för att uppnå ett tillräckligt ackumulerat antal glest distribuerade prekursorer, samtidigt som det totala antalet transplanterade djur hålls på ett minimum. Sist men inte minst, samtidig injektion av olika fluoro-märkta, “test” och “kontroll” prekursorer och efterföljande Pairwise statistisk analys av resultaten motverka effekterna av Inter-Animal experimentell variation, vilket gör det möjligt att nå statistisk signifikans av resultat, även vid analys av ett begränsat antal individer13.
Det bör betonas att denna metod, om än snabb och billig, har två huvudsakliga begränsningar. För det första är den utformad för att undersöka cell-autonom gen kontroll av neuronala arkitektur, och det är inte lämpligt att ta itu med miljökontroll. För det andra, som transplanterade neuronala prekursorer nå sin slutliga plats genom ett heterokroniskt schema, är denna metod att föredra att modellera neuroarchitectonics kontroll inträffar tidigare migration slutförande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Specifika aspekter/steg i detta förfarande är kritiska och kräver särskild uppmärksamhet. För det första måste (a) operatörerna vara tillräckligt utbildade för att på ett säkert sätt manipulera lentivirus i en BSL-2-kompatibel labbmiljö. För det andra, (b) före blandning “test” och “kontroll” neurala preparat, är det obligatoriskt att noggrant tvätta de två motsvarande neurosphere suspensioner som beskrivs, för att förhindra fördröjd korsinfektion av de två preparaten på grund av oönskade lenti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mihn Duc göra för hans bidrag till tidig inrättandet av detta förfarande.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
Riferimenti
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
