Svømning induceret lammelse at vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans
Summary
Svømning induceret lammelse (SWIP) er en veletableret adfærdsmæssige analysen bruges til at studere de underliggende mekanismer af dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dog mangler der en detaljeret metode til at udføre analysen. Her, beskriver vi en trinvis protokol for SWIP.
Abstract
Svømning analysen er beskrevet i denne protokol er et gyldigt redskab til at identificere proteiner regulering af dopaminerge synapser. I lighed med pattedyr, dopamin (DA) styrer flere funktioner i C. elegans herunder læring og motoriske aktivitet. Betingelser at stimulere DA release (fx amfetamin (Ladeeffekt) behandlinger) eller at forebygge DA clearance (f.eks. dyr mangler DA transporter (dat-1) som er i stand til reaccumulating DA i neuroner) generere et overskud af ekstracellulære DA i sidste ende resulterer i hæmmet locomotion. Denne adfærd er især tydeligt, når dyr svømme i vandet. I virkeligheden, mens wild-type dyr fortsætter med at svømme i en længere periode, dat-1 null mutanter og wild-type behandlet med Ladeeffekt eller hæmmere DA transportørens synker til bunden af brønden og Flyt ikke. Dette problem kaldes “Svømning induceret lammelse” (SWIP). Selvom SWIP analyse er veletableret, mangler en detaljeret beskrivelse af metoden. Her beskriver vi et trin for trin guide til at udføre SWIP. For at udføre analysen, er sent larve fase-4 dyr placeret i en spot glasplade, der indeholder kontrolelementet rørsukkeropløsning med eller uden Ladeeffekt. Dyr er scorede for deres svømning adfærd enten manuelt af visualisering under en Stereoskopet eller automatisk ved optagelse med et kamera monteret på Stereoskopet. Videoer er derefter analyseret ved hjælp af en tracking software, som giver en visuel repræsentation af prygl frekvens og lammelse i form af varme kort. Både manuel og automatiseret systemer sikrer en let kvantificerbare udlæsning af dyrenes svømning evne og dermed lette screening for dyr bærer mutationer i det dopaminerge system eller hjælpeansatte gener. Derudover kan SWIP bruges til at belyse virkningsmekanismen af medicin misbrug såsom Ladeeffekt.
Introduction
Dyr udføre en række medfødte og komplekse adfærd, der er medieret af forskellige neurotransmittere koordineres af indviklede signaling processer. Neurotransmitteren dopamin (DA) formidler meget bevaret adfærd på tværs af arter, herunder læring, motorik og belønning behandling.
Jord nematode C. elegans, med en forholdsvis enkel og godt kortlagt nervous system bestående af kun 302 neuroner, viser markant komplekse adfærd, herunder mange, der er reguleret af DA parring, læring, fouragering, bevægelse, og æglægning 1. blandt andre funktioner, korte livscyklus, nem håndtering og bevarelse af signalering molekyler, fremhæve fordelene ved at bruge C. elegans som en model til at studere det neurale grundlag af bevarede adfærd.
Hermafrodit C. elegans indeholder otte dopaminerge neuroner; Udover disse indeholder mandlige seks ekstra par til parring formål. Pattedyr, disse neuroner syntetisere DA og express DA transporter (DAT-1), en membran protein findes udelukkende i dopaminerge neuroner, som transporterer DA udgivet i den synaptiske kløft tilbage i de dopaminerge neuroner. Desuden, de fleste af proteiner involveret i hvert trin i syntesen, emballage og frigivelse af DA er meget bevaret mellem orme og mennesker, og som i pattedyr, DA modulerer fodring adfærd og bevægelse i C. elegans2.
C. elegans kravler på faste overflader og svømmer med en karakteristisk gennemdrøfte opførsel i vand. Interessant, mutanter mangler udtryk for DAT-1 (dat-1) kravle normalt på fast overflade men undlader at opretholde svømning når nedsænket i vand. Dette problem blev kaldt svømning induceret lammelse eller SWIP. Tidligere forsøg påvist, at SWIP, delvis er forårsaget af et overskud af DA i den synaptiske kløft, der i sidste ende overstimulates D2-lignende postsynaptiske receptorer (DOP-3). Selv om oprindeligt identificeret i dat-1 knockout dyr3, SWIP til er også observeret i wild-type dyr behandlet med narkotika at blokere aktiviteten af DAT (fx imipramin4) og/eller fremkalde DA release (fx amfetamin5). På den anden side, forhindre farmakologiske eller genetiske manipulationer afværge syntese og frigivelse af DA og blokerer DOP-3 receptor funktion SWIP6. Taget sammen, har disse allerede offentliggjorte data etableret SWIP som et pålideligt redskab til at studere de adfærdsmæssige effekter forårsaget af muterede proteiner i dopaminerge synapser3,4,7 og skal anvendes til videresende genetiske skærme til identifikation af nye regulerende veje involveret i DA signalering7,8,9,10,11,12. Derudover ved at give en let kvantificerbare udlæsning af narkotika-induceret adfærd i levende dyr, SWIP giver mulighed for belysning af mekanismer for stoffer som amfetamin (Ladeeffekt) og azaperon på dopaminerge synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoller til at udføre SWIP assays har været beskrevet før16. Her, beskriver vi i detaljer den metodologi og setup til at udføre analysen med målet om at give en visuel guide til C. elegans Fællesskabet effektivt udføre SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en trinvis protokol for at udføre en adfærdsmæssige analyse, SWIP, i C. elegans. Denne protokol er enkel og ligetil med ingen store tekniske forhindringer gør dette assay meget bruger venligt. Alligevel er der nogle vigtige aspekter, der skal overvejes for at effektivt udføre analysen.
Pleje bør tages til at sikre, at ormene bruges til analysen er godt fodret, da kosten restriktioner påvirker SWIP17. Skånsom håndtering af orme mens pi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Osama Refai fra Dr. Randy Blakely lab for vejledning med automatiseret analyse af SWIP. Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH R01 DA042156 til LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Riferimenti
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
